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碱变性法小量提取质粒 DNA的限制性酶切厦门大学医学院分子生物学实验教学组目的 掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法:最常用的提取基因工程中运载基因的载体 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶,设计构建体外重组分子 质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复 制的遗传单位,包括真核生物的细胞器和 细菌细胞中染色体以外的DNA分子,在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。质粒DNA的提取方法 方法:碱裂解法;煮沸裂解;羟基磷灰石柱层析 法,质粒DNA释放法;酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA,根据实验所需) 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素:质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求碱裂解法基本原理:1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状,离心时可沉淀下来2.在一定电场强度下,DNA分子的迁移取决于分子 筛效应,即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质 量不同的DNA片段泳动速度不一样),且DNA分子的 迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因 此,凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的 DNA分子:其中超螺旋结构泳动最快,其次为线性 结构,最慢的可能是复制中间体(没有复制完的两 个质粒连在一起),而不是开环结构(用EcoRI来 线性化质粒后再进行琼脂糖电泳,就会看到线性质 粒DNA的位置与这三条带的位置不一样)3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐),其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间,在紫外线的激发下,发出橙色荧光 原理示意图 限制性核酸内切酶: 一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解 酶。 限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二 酯键,产生的DNA片段5端带磷酸基团,3端 为-OH。限制性核酸内切酶分类 识别切割特性 催化条件 是否具有修饰酶活性 至2005年1月,共发现限制酶3681种 型59种 型3612种 型10种 商业化的限制酶有 588 种,在 型限制 酶中共有 221 种特异性。型限制与修饰系统 占90%以上,即通常指的DNA限制性内切酶,它们 能识别双链DNA的特异顺序,并在这个顺序内进行 切割,产生特异的DNA片段; 型酶分子量较小,仅需Mg2+作为催化反应的辅助 因子,识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺 序; 型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口:5 端突出,3端突出和平末端。 酶切反应中应注意以下几个问题: 1. 内切酶:不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶 或外切酶的污染;注意内切酶的识别位点和形 成的粘性末端; 2. 内切酶的用量:根据内切酶的单位和DNA用量而 定。使用中一般以1 g DNA用2-3U酶进行酶切 为宜; 3. 内切酶体积:不能超过反应体系的10%,因内切 酶中含50%甘油,体系中甘油超过5%会抑制内切 酶的活力; 4. 操作条件:应在低温下进行(冰上);使用时防 止操作中对内切酶的污染。5. DNA:作为内切酶的底物,DNA应该具备 一定的纯度,其溶液中不能含酚、氯仿、 乙醚、SDS和酒精等,这些因素的存在均 在不同程度影响限制性内切酶的活性。 反应缓冲液:1. 反应缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+ 组成,其中Mg2+ 为内切酶的辅基; A. Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.27.6之 间; B. NaCl浓度:低盐(10mM NaCl)中盐(50mM NaCl)高盐(100mM NaCl)2. 酶解的温度:大多数限制酶的反应时间为37 ,如EcoR、Hind、BamH、Pst等,也 有如Bcl需在50下进行反应。 3. 酶解反应时间:根据酶的单位与DNA用量之比 来定,原则是酶/DNA23,12小时即可充分 酶解。 4. 酶单位定义:在每种内切酶理想的反应条件下 , 0.05mL反应混合物中, 1小时消化1g底物 DNA的酶量为1单位(1U)。三 质粒提取实验材料与试剂 (一)实验材料: 过夜培养大肠杆菌DH-5a (二)实验试剂: LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL(pH8.0)、 1mM EDTA、 Amp 50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、琼脂糖 TE:10mM Tris.CL (pH8.0),1mM EDTA 溶菌酶 10mg/ml(用10mM Tris.CL,pH8.0,新鲜配 制) 溶液溶菌液: 50mM 葡萄糖,25mM Tris.Cl(pH8.0),10mM EDTA ,2mg/ml 溶菌酶。 溶液 NaOH-SDS液:0.2N NaOH,1% SDS。 溶液 3mol/L NaAc(pH4.8)溶液:5M KAC 10ml,冰醋酸 11.5ml,水 28.5ml。四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中( 含Amp 50g/ml),37 225rpm振荡培养过夜。(活化菌种)2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中, 37振荡培养3-4小时(OD6001.0) 3.取4ml培养液至Eppendorf管中,12000 rpm,4 离心30秒,弃上清,用1ml STE悬浮菌体,再离 心回收菌体,并重复一次,弃上清,取沉淀。步骤二 质粒提取1. 取4ml培养物至Eppendorf管中,12000rpm,4 ,离心30sec,弃上清。 2. 用1ml STE悬浮菌体,再离心回收菌体,并重复 一次,弃上清取沉淀,使细胞沉淀尽可能干燥 。 3. 将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中,加入 10 l溶菌酶(10mg/ml),剧烈振荡均匀,冰 上放置1分钟。 4. 加200L溶液II(新鲜配制),盖紧Eppendorf 管,快速轻柔颠倒5次,混匀内容物,将 Eppendorf管放在冰上3分钟 。5.加入150L溶液III (冰上预冷),盖紧管口,颠 倒数次使混匀,冰上放置5min。 6.12000r/min, 4 离心5min,将上清夜转至另一 1.5ml Eppendorf管中。 7.加入等体积酚/氯仿(1:1),振荡混匀,室温放 置5-10min,12000 rpm,4 下离心2分钟,倒去上清,把Eppendorf管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇,振荡混匀,12000 rpm 4 离心5分钟。 9. 倒去上清,加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗 DNA沉淀。12000 rpm,4 离心2分钟。 10弃上清并尽量吸除液体,打开管盖,室温放 置5min。室温放置15min干燥。 1150L TE缓冲液(含无DNase的RNase 20 g/ml) ,使DNA完全溶解(-20保存) 12取样品10 l加2ul 6 Loading buffer于1 %琼脂糖电泳,电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。双酶切实验材料 限制性内切酶:EcoR、Xba和Hind DNA:DNA和质粒pCDNA-p38 10buffer H (37, PH7.5)90mM TrisCl50mM NaCl10M MgCl2 10buffer M(37, PH7.5)6mM TrisCl100mM NaCl6M MgCl2 1mM DTT 10BSA: 1mg/ml 无菌水方法和步骤1. 反应体系配制: 质粒pCDNA3p38 10 l(1g)10buffer M 2 l10BSA 2 lEcoR 1 lXba 1 lH2O 4 l总体积 20 l2. 将反应体系充分混匀,并于台式离心机上短暂离 心收集液体。 3. Eppendorf管于37水浴中反应23小时。 4. 反应结束后70灭活15min或者加入EDTA至终浓 度10mM终止反应。 5. 取20l反应液加入6loading buffer混匀于1.2 琼脂糖凝胶胶上150伏电泳,约30min 加入5l 未酶切对照。 6. 凝胶成像体系观察记录结果。 7.当DNA条带充分分开后,在紫外灯下细心切取所要 的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射 DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线 伤害。五 实验结果 双链DNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释 倍数50/1000。 RNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数 40/1000。 (在波长260nm紫外光下,1 OD值的吸光度相当于双 链DNA浓度为50g/ml;单链DNA为37 g/ml; RNA为40 g /ml。)凝胶成像结果1.2% Agarose Gel1 2 3 41.1000bp DNA ladder 2. CDNA3-p38/EcoRI+XbaI 3. ppCDNA3-p38 4.100bp DNA ladder六注意事项 为提高质粒产量,要注意下面步骤: 加入溶液I 后,涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮; 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ,使蛋白质和核酸变性; 加溶液III后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次 ),使质粒DNA复性,这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开,否则,难分开,所以裂解和复性这两步要从严掌握。 加入乙醇沉淀DNA时,要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次,注意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后,才可以放到冰箱中去沉淀DNA。 七思考题1.要得到高质量质粒样品,用碱变性法小量提取质 粒时要注意什么事项? 2.溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么?在实验 中分别加入上述溶液后反应体系出现的现象及其 成因是什么? 3.酚氯仿抽提时DNA溶液体系出现什么现象?为什么 ? 4.沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条 件下进行?5. 在整个酶切反应过程中应注意哪些问题?6. 如何选择DNA和限制性内切酶的用量?7. 反应体系中为何内切酶用量不能超过整个 反应体系的10%?注意 EB是诱变剂,配制和使用EB染色液时,应带乳胶手套或一次性手套,并且不要将该染色液洒在桌面或地面上,凡是沾污EB的器皿或物品,必须进行清洗或弃去
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