重组DNA大肠埃希菌俗名大肠杆菌 是人和动物肠道中最主要的细菌之一 是正常菌群的成员 出生后数小时就进入肠道，并伴随终生 能合成维生素B和K，供人体利用 能抑制腐败菌及病原菌（如金黄色葡萄球菌、志贺菌属） 真菌（如白念珠菌）的过度增殖 异位寄居时可引起肠外感染 某些菌株有致病性消化道感染，导致腹泻等 每个人每天平均从粪便中排出1011到1013个 可作为粪便污染的检测指标 常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究 基因工程的工具菌生物学性状 形态与染色 G- 杆菌，13m（短 杆菌） 两端钝圆、无芽孢 有周鞭毛 有普通菌毛/性菌毛 能运动卫生细菌学检查 大肠菌群 指37OC24h内发酵乳糖产酸产气 包括埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属及肠杆菌属 等 大肠菌群指数 指1000 ml被检样品中的大肠菌群数 生活饮用水的水质标准coli-index 3个 我国2007年开始实施的卫生标准规定 每100ml生活饮用水中，不得检出总大肠菌群、耐热大 肠菌群和大肠埃希菌 1、细菌培养-平板培养划线法培养涂布法培养大肠杆菌的培养限制性内切酶EcoR I内切酶限制性内切酶:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切 酶。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化 非甲基化的DNA的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基 化的DNA的水解。分子剪刀沃纳阿尔伯1929年生于瑞士。苏黎士工 科大学毕业后，在日内瓦大 学获得博士学位。1971年起 ，任巴塞尔大学教授。在研 究噬菌体的遗传现象时，成 功地分离出DNA的限制性酶和 甲基化修饰酶，为此获1978 年诺贝尔生理学医学奖。 限制修饰现象K （B） （B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的噬菌体第一次感染K菌株， 形成的噬菌斑很少， 生长受寄主限制K （K）存活下来的噬菌体再次感染 K菌株，则形成的噬菌斑 很多，不受限制EOP:Efficiency of plating（ 生长在不同寄主中的噬菌 体的成斑率，表示限制程 度）说明K和B菌株中存在一 种限制系统可排除外来的 DNA； 10-4的存活率是由宿主限 制系统作用的结果产生这种现象的原因何在甲基化酶：能使细胞自身核酸的内切酶识别序列的碱基甲基化，从 而使自身核酸免受内切酶水解细菌的“防御”系统核酸内切酶：识别并水解外源DNA（外来核酸在内切酶识别序列上没 有甲基化修饰作保护）研究发现：原来是由两种酶配合完成，一种是起修饰 作用的甲基化酶，另一种是核酸内切酶限制修饰限制修饰体系K （B） （K） （B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的噬菌体K （K）再次感染K菌株，则形成 的噬菌斑很多，不受限制 （K菌株已经对其进行了 修饰） （B）噬菌体感染大肠杆菌K 菌株后，其DNA大部分被内切 酶降解了，但有极少部分能在 特定序列甲基化，避免被酶解 ，因此有少量噬菌斑形成。在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型的细菌 可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA （如噬菌体DNA等），使得外源DNA对生物细胞 的入侵受到限制；而宿主细胞自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的 作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得 到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是 限制修饰系统中修饰作用的含义。限制修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分 解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳 定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。分类核酸外切酶核酸内切酶核酸酶从核酸链的一端开始，一个接一个地消 化降解核苷酸从核酸链分子内部切割3，5磷酸二酯键 ，使之断裂形成小片段核酸内切酶：按限制性酶的组成、限制和修饰活性、切断核酸的情 况不同，分三类（I， II ，III），通常指的是II型。命名法H i n d III同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶如从流感嗜血杆菌d菌株（Haemophilus influenzae d）先后发 现3种限制性酶，则分别命名为HindI， HindII，HindIII大肠杆菌R菌 株REscherichia嗜血流感杆 菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名 （型号）种名的头两个字母宿主属名的第一个字母coli前3个字母代表来源的生物 随后1个字母或阿拉伯数字代表菌株最后1个罗马字母代表发现或鉴定的次序 基本特征识别并切割双链DNA（环状或线状 ）分子中4-8bp的特定序列结构特征：旋转对称的回文结构 切割后产生的末端：Cohesive terminus or Blunt end（粘性末端 或平末端）EcoR I的识别序列5G C T G A A T T C G A G 3 3C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的切割位点质粒质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1200kb不等，为 双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中 。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主 复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表 达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞 编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿 主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一 些额外的特性，如对抗生素的抗性等。 莱德伯格（19252008），美国遗传学家。细菌遗传学的创始人之一。1925 年5月23日生于美国蒙特克莱市。1944年获哥伦比亚大学学士学位，以后曾 在医学院学习，不久转入耶鲁大学，于1947年获博士学位。1959年起任斯 坦福医学院教授兼遗传学系主任。1962年任肯尼迪分子医学实验室主任。 他在耶鲁大学期间，发现细菌的遗传重组。1946年，他和E.L.塔特姆 发现遗传重组的普遍性。1952年发现细菌的F因子。1952年发现沙门氏菌中 的普遍性转导，1953年发现大肠杆菌的温和噬菌体在染色体上占有一定 位置。1956年发现噬菌体能进行局限性转导。他们的研究工作还包括应 用细菌的有性生殖和转导进行细菌的免疫学和代谢作用等方面的研究。1958年他和G.W.比德尔和E.L.塔特姆共同获得诺贝尔生理学或医学奖 。 接合现象的发现接合：指通过细菌细胞的直接接触，遗传物质从供体转移到受 体并发生重组的过程。1946年莱德伯格和塔特姆发现了细菌的接合。细菌的杂交实例（1946）不同营养缺陷型的大肠杆菌（K12）： A菌株：met- bio- thr+ leu+ thi+，B菌株：met+ bio+ thr- leu- thi- 这种野生型细胞如何出现的？U型管实验：A、B菌株分别培养在基本培养基上 一边加压 和吸引使培养液充分混合 结果任何一臂的培养基上均未长 出野生型细菌。结论：菌株A与菌株B细胞直接接 触（接合）是野生型细胞出现的 必要条件；两菌株直接接触后导 致遗传物质转移，进而发生基因 重组，产生野生型细菌。试验证明： 接合过程是一种单向转移，A菌株遗传物质 B菌株，从 供体到受体。用大肠杆菌K12的菌株A和菌株B，首先用高剂量的链霉素 处理菌株A或菌株B ，把处理过的菌株A跟未处理过的菌株 B混合，或把处理过的菌株B跟未处理过的菌株A混合，发 现结果大不相同： F 因子：致育因子或称性因子，是一种附加体。携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F表示。未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F表示。F因子及F向F的转移 F因子的结构染色体外遗传物质（质粒），环状DNA，9104 bp，大约为 大肠杆菌环状染色体的2%，具有4060个蛋白质基因。每个细胞（F）有24个。 F因子分为三个区域： 自主复制区：有转移的起点和2个复 制起点。复制起点Ori T是在染色体 转移时进行滚环复制时的复制起点； Ori V是在营养时期，即游离在细胞 质中独立复制时的复制起点。转移区：主要有合成性伞毛即F纤毛 （F pili）的操纵子。F纤毛是由性 伞毛蛋白构成，呈管状，又叫接合管 。通过接合管可将供体和受体细胞相 联。共30kb长，有40个基因与DNA的 转移有关。重组区：有4个插入顺序（IS），通 过和宿主染色体 上的IS同源重组或通过转座，F因子 可以整合到宿主不同位点上。 F 因子的三种状态有一个自主状态的F因子，即F细胞； 带有一个整合的F因子的细胞叫高频重组细胞，Hfr细胞。没有F因子，即F细胞；F与F菌（1）有F因子的细菌称为F，细菌增殖时可把F因子传递给后代细胞（通过自主复制）。（2）没有F因子的细菌称为F，F细菌经吖啶橙处理而丢失，成为F。F因子一经丢失，细胞中便不再出现；（3）F可以和F杂交，而不能和F杂交；（4）F菌与F菌混合（即FF）1小时后，约 95%的F菌转变为F菌，而原来的F仍然保留有 F因子。(1) F纤毛合成：由性伞毛蛋白 构成，接合管使供体和受体 细胞接触。 (2) 转移启动：F因子从转移复 制起点(Ori T)开始向F 转移（ 5端首先进入受体）。(3) 单链转移，滚环复制。F纤毛与接合管FFHfr 是F因子整合到E.coli 染色体上的结果(1)E.coli染色体上有20个以上的整合位点； (2)整合通过IS等同源重组或转座实现； (3)F因子有多个整合位点，主要在IS3处。分子克隆pUC18pUC19含四个部分： （1）来自pBR322的质粒复制起点 （ori）；（2）ampr ; （3）大肠杆菌半乳糖苷酶基因 （lacZ）的启动子及其编码- 肽链的DNA序列； （4）多克隆位点（MCS）lacZOriAmprMCS蓝白斑筛选重组子的原理：lacZ 编码半乳糖苷酶的肽，在异丙基硫代- -D-半乳糖 苷（IPTG）的诱导下，使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚- - D-半乳糖苷（X-gal）被分解产生蓝色。因此携带空载体的大肠杆菌呈蓝色菌落。外源基因的插入使肽失活，因而携带外源基因的重组子菌 落呈白色。利用菌落颜色筛选重组子PUC质粒载体的优点：基因组小，拷贝数高，DNA产量高； 有LacZ筛选标记，LacZ基因插入失活，可用蓝白斑筛选阳性克隆；有MCS，其中有13个以上的单一限制位点，可用于外源基因克隆。意义与应用 重组DNA技术的出现和应用开辟了分子遗传 学研究的新领域，打开了人类了解、识别 、分离和改造基因，创造新物种的大门。 它的成就对于工业、农牧业和医学产生深 远影响，并将为解决世界面临的能源、食 品和环保三大危机开拓一条新的出路。 Frankenstein（译作“科学怪 人”或“弗兰肯斯坦”）是英国诗人 雪莱的妻子玛丽雪莱在1818年 创作的小说，被认为是世界第一 部真正意义上的科幻小说。“弗 兰肯斯坦”是小说中那个疯狂科 学家的名字，他用许多碎尸块拼 接成一个“人”，并用电将其激活 。Frankenstein已经成为科 幻史上的经典，现在很多幻想类 影视作品中经常出现这个怪物的 翻版。