高效液相色谱法高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)HPLC)20.1.1 20.1.1 高效液相色谱法的产生和发展高效液相色谱法的产生和发展高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世， 导致高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的产生。 薄壳型填料，柱效 仅每米10003000 塔板数510m球型和无定 型微粒硅胶，每米 56万理论塔板数 高度均匀甚至单分 散13m硅胶基质 球形填料，达1530 万理论塔板/m。 新型分离模式和 方法不断增加 基本特点1. 高效、高速、高灵敏度、高选择性 2. 填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3局限性 操作条件1. 流动相对分离选择性的影响 2. 柱外效应 3. 操作压力 适用范围广20.1.2.高效液相色谱法的特点及与其他色谱法比较1. 吸附色谱(adsorption Chromatography) 2. 分配色谱(partition Chromatography) 3. 离子交换色谱(ion-Exchange Chromatography) 4. 体积排阻色谱(size Exclusion Chromatography)需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作 用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系根据固定相和液体流动相相对极性 的差别，有正相色谱和反相色谱两种色 谱体系或方法。反相色谱和正相色谱主要区别是流 动相和固定相的相对极性，最初形成于 液液分配色谱，现已广泛应用于其他各 种色谱方法。上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方 法。这些方法可用于分析分离，也可用于制备分离，各 色谱方法在相关领域应用互相补充。20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系现代高效液相色谱使用310m柱填料，为达到 适用的流动相流速，高压泵需提供几十MPa或数百大 气压力的柱前压。因而HPLC仪器比其他类型的色谱仪 要复杂和昂贵。20.2. 高效液相色谱仪HPLC示意图20.2. 高效液相色谱仪现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器 ，一般为玻璃瓶。每个储瓶容积5002000mL。储液瓶 位置要高于泵体，以保持一定的输液静压差，在泵启 动时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀 排出。储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置 ，这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检 测器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅 拌下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性 气体带出溶解在溶剂中空气。储液器的溶剂导管入口 处装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣 ，防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。20.2.1.流动相贮器和溶剂处理系统通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50- 500)105Pa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流 速范围0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系 统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压 泵产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性 极小。最重要的是系统密封性能好。目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞 泵、气动放大泵、螺旋注射泵，它们各有优、缺点。往复柱塞泵 20.2.2.高压泵系统1.电机，2.往复凸轮，3.密封柱 塞，4.吸排液单向阀，5.溶剂入 口，6.脉动阻尼器,7.接色谱柱 。高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5 30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较 突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的 峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测 器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展 宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因 此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 进样阀20.2.3.进样系统六口旋转进样阀示意图色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定 相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光 滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管 用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝 胶色谱柱内径312mm，制备往内径较大，可达25mm 以 上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和 分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为 其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中 固定相，保证分离的性能不受影响。20.2.4.高效液相色谱柱1.1.色谱柱类型色谱柱类型按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半 制备柱、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。20.2.4.高效液相色谱柱2.2.保护柱保护柱 一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除 去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中 含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的 分析柱，延长使用寿命。3.3.柱恒温器柱恒温器 对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留 值和更好分离色谱图。在液相色谱中，有两种基本类型的检 测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分 离组分的物理或化学特性有响应，属于这 类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器 等。另一类是总体检测器，它对试样和洗 脱液总的物理或化学性质有响应，属于这 类检测器的有示差折光，电导检测器等。20.2.5.液相色谱检测器l. 光吸收检测器：紫外吸收检测器，光二极 管阵列检测器，红外吸收检测器 2. 荧光检测器 3. 示差折光率检测器 4. 蒸发光散射检测器 5. 电化学检测器 20.2.5.液相色谱检测器20.3.1. 高效液相色谱固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类， 可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化 硅为基质，可承受7.O1081.O109Pa的高压，可 制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧 化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩 大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚 苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多 孔型和全多孔型固定相两类。 20.3.高效液相色谱固定相和流动相由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分 有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正 确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶 剂的要求是： 1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化 学反应，保证柱的稳定性和分离的重现性。 2.适用的物理性质，包括沸点较低，以便于分 离组分和溶剂回收;低粘度，利于提高传质速率和分 离速度、降低柱前压;弱或无紫外吸收等，以降低UV 检测器本低响应，提高检测灵敏度;对样品具有适当 溶解能力等。 3.溶剂清洗和更换方便，毒性小、纯度高、价 廉等，便于操作和安全。20.3.2. 液相色谱流动相20.3.2. 液相色谱流动相20.4.吸附色谱(Adsorption Chromatography)20.4.1.液固吸附色谱固定相吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂 ，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性 容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反 应等，因此，以硅胶用得最多。在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附 色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点 ，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前 最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂 表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当 试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固 定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被 吸附的流动相溶剂分子。于是，在固定相表面发 生竞争吸附:20.4.2吸附色谱分离机理研究最多、应用最广泛的高效液相色谱 类型。 可分为液-液色谱和化学键合相色谱。前 者是早期主要分配色谱类型，以物理吸附涂 渍固定液在多孔载体表面上为固定相；后者 以键合相为固定相，即化学键合固定相至载 体或基质表面。化学键合相色谱巳成为占绝对优势的分 配色谱类型。 20.5.分配色谱(Partition Chromatography)液一液分配色谱法（LLPC）在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体，能 适用于各种样品类型的分离和分析（极性的和非极 性的、水溶性和油溶性的、离子型的和非离子型的 化合物）。 （1）分离原理液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同 ，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的 不同，具有不同的分配系数。不同的是液液色谱的 分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次 进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率， 从而能分离各种复杂组分。（2）固定相由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此， 对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固 定液即可解决分离问题。为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生 了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过 化学反应键合到载体表面的一种方法。代替了固定 液的机械涂渍，它的出现是液相色谱法的一个重大 突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。约有 3/4以上的分离分析是在化学键合固定相上进行的 。（3 ）流动相在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动 相的一个基本要求是流动相与固定相尽可能不互溶 ，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根 据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为 正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动相的 极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适 用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先 流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大 于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非 极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相 反。此法是利用离子交换原理和液相色 谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴 离子的一种分离分析方法。凡在溶液中 能够电离的物质，通常都可用离子交换 色谱法进行分离。它不仅适用无机离子 混合物的分离，亦可用于有机物的分离 ，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大 分子。因此，应用范围较广。 20.6.离子交换色谱离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相 亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交 换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离 的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与 树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反 应通式如下： 阳离子交换： 阴离子交换： 20.6.1.离子交换平衡体积排阻或排除色谱(Size-Exclusion Chromatography,SEC),亦称为凝胶色谱或凝胶过滤色 谱,是分析高分子化合物的色谱技术。SEC填料为微粒 均匀网状多孔凝胶材料。比填料平均孔径大的分子被排阻在孔外而无保留 ，被最先洗出;分子体积比孔径小的分子完全渗透进 入孔穴，最后洗出; 处于这两者之间具中等大小体积 分子渗透进入孔穴，由于渗透能力差异而显示保留不 同，产生分子分级，这取决于分子体积，在一定程度 上亦与分子形状有关。因此，SEC分离是基于溶质分子体积差异在凝胶 固定相孔穴内的排阻和渗透性大小。20.7.体积排阻色谱20.7.1.分离原理凝胶色谱法原理分离类型的选择1据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适 用于气相色谱。标准液相色谱类型（液固、液液 、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是 2002000。对于相对分子质量大于2000的样品， 则用尺寸排阻法为最佳。 2根据溶解度选择清楚样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙 醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水属则 属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样 品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用用液固 吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙 醇时，