2008 Waters Corporation 12008 Waters Corporation样品前处理技术基础理论Waters Chemistry OperationsWaters Chemistry Operations2008 Waters Corporation 2培训概要样品前处理的重要性及原则一样品前处理一般性步骤二样品前处理方法及比较三固相萃取技术四2008 Waters Corporation 3样品前处理的重要性及原则一样品前处理一般性步骤二样品前处理方法及比较三固相萃取技术四2008 Waters Corporation 4样品前处理的重要性 重要性样品前处理在色谱分析过程中是一个既耗时又极易引 进误差的步骤，样品处理的好坏直接影响色谱分析的最终结 果，因此，为了提高分析测定效率，改善和优化色谱分析样 品制备方法和技术是一个重要问题。由于食品样品属于复合基质体系,多含有蛋白、油脂,碳 水化合物、色素等成分,复杂的基质背景会对被分析目标化合 物的提取、分离、净化和测定等带来很大的麻烦,因此食品的 样品前处理不仅复杂困难,而且对于分析结果的准确可靠和灵 敏具有决定性作用。2008 Waters Corporation 5为何需要样品前处理?色谱分析的误 差来源 2008 Waters Corporation 6为何需要样品前处理?样品前处理所消耗时间 2008 Waters Corporation 7对于LC/MS/MS高灵敏度的仪器, 适当的样品前处理对于减少基 质干扰和富集组分至关重要！为何需要样品前处理?60%以上的工作和费用花费在样品前处理上三个目的: 除去样品基质中的干扰物 富集组分 增强仪器的性能2008 Waters Corporation 8样品前处理原则u原则制备过程中避免组分发生化学变化；要防止和避免欲测定组分的沾污；尽可能减少无关化合物引入制备过程；尽可能简单易行。2008 Waters Corporation 9样品前处理的重要性及原则一样品前处理一般性步骤二样品前处理方法及比较三固相萃取技术四2008 Waters Corporation 10样品处理一般性步骤离 心过 滤液-液萃取 SPESPME根据样品类别 和被分析物的 结构、极性等 理化性质选择 合适的提取溶 剂GCGC-MSHPLC LC-MSCE提取净化测定2008 Waters Corporation 11样品前处理的重要性及原则一样品前处理方法及比较二样品前处理方法及比较三固相萃取技术四2008 Waters Corporation 12样品预处理技术分析被测物在样品 基质中提取2008 Waters Corporation 13样品预处理的目的 除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护 溶剂置换2008 Waters Corporation 14样品的预处理重要性 占样品分析时间的比例样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤2008 Waters Corporation 15常见样品前处理方法常见样品前处理包括:液液萃取稀释固相萃取离心过滤样品前处理样品前处理沉淀2008 Waters Corporation 16样品前处理的各种方法方法选择性基础沉淀溶解度液液萃取样品在两相中的分配固相提取样品在吸附剂上的吸附与分配渗析/超滤分子量与体积电泳电荷/淌度蒸馏/蒸发沸点与蒸气压2008 Waters Corporation 17传统的样品前处理方式 液液萃取 (LLE)根据分析物在互不相溶的两相中的溶解度差 异来将分析物从一相提取至另一相中。 C 装置简单 C 操作容易 C 常被认定为成本低廉 D 费时费力 D 常因乳化效益使相间分层不彻底，使得重复样的分析结果存在显著 偏差(常在10%20%之间) D 若需萃取的样品体积大（如环境分析中），则可能消耗大量的有机 溶剂。由此可能在购买、储藏、处置溶剂时花费庞大*。注: 大量储存、使用和处置溶剂可对操作者的长期健康产生负面影响， 并可带来火灾隐患有机层水层2008 Waters Corporation 18传统的样品前处理方式 蛋白质沉淀法 (PPT)1- 吸取200 L血浆 2- 加入400-600 l乙腈 3- 高速混合 4- 离心取上清液 5- 以水稀释后进样在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使 样品中的蛋白质沉淀，然后经离心去除 C 简单快速 C 可被自动化，适用于高通量分析 C 若检测限要求不高时较适用 D 属快速但粗糙的净化技术， 仅可去除约90-95%的蛋白质，而基质 中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未被去除（此为LC/MS 分析时遭遇离子抑制的根源!） D 分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗 D 导致样品稀释, 不适合用于超痕量分析场合 D 进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无内标，分 析重现性不佳) 2008 Waters Corporation 19固相萃取技术 (SPE) 先进的样品前处理方法C 可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物并浓缩样品 分析结果呈高度可靠性 使得检测灵敏度和选择性大大提高 明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度 C 样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少 C 分析结果的精密度提高(偏差常 18 0.25 meq/gNOCOOHOasis WCXpKa 5 0.75 meq/gCOO- + H+2008 Waters Corporation 46O HNCH3CH3普萘洛尔H H+反相作用强阳离子交换作用（碱性药物）MCX吸附剂NOSO-3SO-3Mixed Mode Cation eXchangerOasis MCX 吸附剂上碱性化合物的作用模式: Mixed-Mode Cationic-eXchanger pKa 182008 Waters Corporation 49Oasis MAX SPE 吸附剂 净化和富集酸性性化合物的强有力工具pH02468101214kAcids (HA)NeutralBases (BH+)A-B清洗2: 100% MeOH (强烈清洗)样品预处理活化/平衡: MeOH/Water上样清洗1: 2% 氨水 (目标锁定)洗脱: 2% 甲酸-MeOH (目标释放)溶剂蒸发/重新定容 (选项)(Oasis MAX 在所有pH下均带正电)2008 Waters Corporation 50若想在Oasis MCX/MAX吸附剂上净 化和富集永久性带电的物质 (如季铵 碱及其盐，有机磺酸及其盐，有机膦 酸及其盐)，能否成功?！2008 Waters Corporation 51永久性带电分析物带来的挑战kAcids (HA)NeutralQ. Base (Q+)A-Q. Base (Q+)带永久性正电的季铵盐在 Oasis MCX上时pHkNeutralBases (BH+)BRSO3-带永久性负电的有机磺酸盐 在Oasis MAX上时Bases (BH+)BA-Acids (HA)RSO3-2008 Waters Corporation 52Oasis WCX & Oasis WAX (2004) 专为永久性带电分析物所设计的吸附剂 Oasis WCX: Mixed Mode Weak Cationic Exchanger Oasis WAX: Mixed Mode Weak Anionic Exchanger 2008 Waters Corporation 53阳离子交换作用反相作用戊沙溴铵 （季铵盐）NOCOO -COO-季铵盐在Oasis WCX吸附剂上的作用模式羧酸的pKa 5pH 3 吸附剂为电中性状态 pH 7 吸附剂呈完全负电状态 Oasis WCXMixed-Mode Weak Cation eXchanger2008 Waters Corporation 54Oasis WCX SPE 吸附剂 净化和富集季铵盐和碱的最佳工具pH02468101214kNeutralBases (BH+)Q+BQ+WCX 带负电WCX 不带电Acids (HA)A-清洗2: 100% MeOH (强烈清洗)样品预处理活化/平衡: MeOH/Water上样清洗1: 2% 氨水 (目标锁定)洗脱: 2% 甲酸-MeOH (目标释放)溶剂蒸发/重新定容 (选项)2008 Waters Corporation 55WAX sorbentMixed-Mode Weak Anion eXchanger阴离子交换作用反相作用哌嗪基团的pKa 6pH 8 吸附剂为电中性状态 pH 4 吸附剂呈完全正电状态磺酸盐 (Strongly Acids)有机磺酸盐在Oasis WAX吸附剂上的作用模式2008 Waters Corporation 56Oasis WAX SPE 吸附剂 净化和富集磺酸盐、磷酸盐的最佳工具pH02468101214kNeutralBases (BH+)RSO3-BWAX 不带电WAX 带正电Acids (HA)A-RSO3-清洗2: 100% MeOH (强烈清洗)样品预处理活化/平衡: MeOH/Water上样清洗1: 2% 甲酸 (目标锁定)洗脱: 2% NH4OH-MeOH (目标释放)溶剂蒸发/重新定容 (选项)2008 Waters Corporation 57固相提取技术的色谱基础液相色谱如何实现分离？固定相被测物 A被测物 B流动相BA2008 Waters Corporation 58如何在反相色谱条件下获得保留？弱极性 非极性 固定相 （吸附剂）弱极性 非极性 被测物A极性 被测物B水溶性 - 极性 流动相C18 - Silica Oasis HLB2008 Waters Corporation 59固相提取过程的一般步骤活化及平衡上样清洗(可选步骤)洗脱被测组分以OasisHLB反相提取为例甲醇和水 样品水溶液 5%甲醇水溶液甲醇2008 Waters Corporation 60一般性分析操作步骤活化:依次用强溶剂、弱溶剂（缓冲溶液）进行活化；上样：用能够溶解样品的弱溶剂携带样品上柱，既要保证样 品分析物的有效溶解，又要确保溶剂强度不至于把被分析化 合物从柱上洗脱下来；淋洗：用具有一定强度的混合溶剂淋洗去除干扰杂质，确保 杂质被洗脱，而被分析化合物有效的保留在柱上；洗脱：用较强的溶剂把被分析化合物从柱上替换洗脱下来。2008 Waters Corporation 61SPE技术对流速的一般要求 活化及平衡 5 -10 mL/min 上样 0.5 - 5 mL/min - 液流不能成线 清洗 1 - 5 mL/min 洗脱 0.5 - 5 mL/min- 液流不能成线 与SPE产品的规格及色谱类型有关2008 Waters Corporation 62净化条件的确定：根据化合物理化性质选择使用的SPE类型制作化合物净化洗脱曲线，强溶剂-弱溶剂以不同比例，由 弱 强逐渐增加洗脱强度，通过仪器测定的回收率来确定 最佳的淋洗和洗脱溶剂组成和比例在确定的洗脱溶剂比例条件下，进一步优化洗脱体积。2008 Waters Corp