凝胶柱色谱分离蛋白质【目的要求】 1、熟悉凝胶色谱分离的基本原理； 2、掌握凝胶柱色谱填充物的装柱、平衡 、加样、洗脱等基本操作技术。【实验原理】凝胶色谱是利用某些凝胶对于不同组分因分子 大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的 技术。当溶液在色谱柱内流过时，各种物质分 子在柱内同时进行向下的移动和不定向的分子 扩散运动。大分子物质由于分子直径大，难于 进入凝胶颗粒的微孔，只能在凝胶颗粒的间隙 中随流动相快速向下移动；而小分子物质能够 扩散进入凝胶颗粒的微孔中，因此在流动过程 中不断地进出于胶粒的微孔，这样就使小分子 物质向下移动的速度落后于大分子物质，从而 使溶液中的各组分按分子量从大到小的顺序先 后流出色谱柱，达到分离纯化的目的。【实验用品】 1、材料葡聚糖凝胶Sephadex G-100、蓝色葡聚糖 2000、溶菌酶 2、试剂（1）蓝色葡聚糖-2000（2mg/mL）和溶菌酶 （6mg/mL）组成的混合液（2）0.025MKCl-0.2M乙酸缓冲液 3、器具色谱柱、铁架台、试管、紫外分光光度计或紫 外检测仪、电炉、容量瓶、烧杯、三角瓶、滴 管、移液管、玻棒。【实验过程】凝胶溶胀：根据预计的总床体积和所用干 胶的床体积，称出所需干凝胶放入大三角 瓶或烧杯中，加入过量的缓冲溶液或去离 子水，浸泡24h以上或沸水浴中煮沸溶胀 23h，冷却至室温。用倾泻法将不易沉下 的较细的颗粒倾去。1、凝胶柱的制备。装柱：升高或关闭色谱柱 的出水口，在柱内先注入约1/3柱高的缓冲液 。轻轻搅动三角瓶中的凝胶（切勿搅动太快， 以免空气进入），使之形成均一的凝胶浆，并 立即缓慢并连续不断地沿玻棒倒入柱中，让其 沉降约12cm高时，然后降低或打开柱的出 水口，让缓冲液慢慢地流出。随着下面水的流 出，上面陆续不断地添加凝胶，直至凝胶完全 沉降至所需的柱高为止，然后在凝胶表面上放 一片滤纸，以防将来在加样时凝胶被冲起。柱 要一次装完，不能间歇，并始终保持凝胶上端 有一段液体。层析分离系统2、平衡：用0.025MKCl-0.2M乙酸缓冲液流 动平衡凝胶色谱柱。开始时，流速控制在 低于0.5mL/min，在平衡过程中逐渐增加到 色谱时的速度即34mL/5min，一般用约 23倍总床体积的缓冲溶液流过柱即可平衡 。3、加样：吸去柱床表面以上的溶液，面上留下 一些液体从柱的出口流出。等到凝胶床面上的液 体正好流干时，小心地用滴管将约1mL蓝色葡聚 糖和溶菌酶的混合液加到凝胶床面上。先使滴管 尖端接触离柱床表面约1cm高处的内壁，随加随 沿柱内壁转动一周，然后迅速移至中央，使样品 尽可能快地覆盖住全胶面，打开下口，以便使样 品均匀地渗入柱内，当样品液下降至与胶面相平 （胶面必须覆盖一层薄薄的溶液）时，关闭下口 。待其正好流干时再加少量缓冲溶液，这样滴入 洗脱液时不会冲动凝胶床面。加样前，如果胶面 不平整，可用玻棒将胶表层轻轻搅起，待其自然 沉降至平整后，方可加样，加样过程中注意不要 破坏胶面的平整。4、洗脱：用0.025MKCl-0.2M乙酸缓冲液进 行洗脱。流速控制在0.25mL/min。每15分 钟收集一管，然后用紫外分光光度计于 280nm处测定每管吸光度（A280）。洗脱过 程中要注意观察蓝色区带向下移动的情况 ，如前沿平齐，区带均匀，说明柱是均匀 的，可以使用。如不均一，必须重新装柱 。以管号（或洗脱体积）为横坐标，吸光度 为纵坐标作出洗脱曲线，并分辨蓝色葡聚 糖-2000和溶菌酶的洗脱峰或洗脱位置。【注意事项】1、色谱柱大小可根据实际需要选择，一般来 说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最 好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。 柱管内径太小时，会发生管壁效应，即柱管中 心部分的组分移动慢，而管壁周围的移动快。 柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间 长，样品稀释度大，分离效果反而不好。2、装好的色谱柱凝胶要均匀，不能有断层或 纹路或气泡，将柱管对着光照方向观察，若色 谱柱床不均匀，必须重新装柱。3、各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要 有破损，否则造成漏气、漏液。操作过程中 ，色谱柱内液面不断下降，则表示整个系统 有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。4、始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水 分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使 凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动 ，导致分离效果变差，不得不重新装柱。5、洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同 ，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化， 从而影响分离效果【思考题】1、凝胶色谱分离有何特点和主要用途？2、做好本实验的关键事项主要有哪些？3、本实验中出现几个洗脱峰？哪个是溶菌 酶的洗脱峰?