第1讲 基因工程一、基因工程1.基因工程的三种基本工具（1）三种工具的比较：（2）限制酶切割时的注意事项：注意切割的序列是否会连接成环：切割图1中的目的基因时，最好不要只用BamH，因为只用BamH切割时，目的基因的两端具有相同的黏性末端，易自行连接成环，因此最好同时用BamH和Hind 切割。限制酶的切割序列具有包含关系：图2中BamH和Mbo识别的碱基序列和酶切位点分别是GGATCC、GATC，这两个限制酶都可切割同一碱基序列GGATCC。切割时注意是否破坏所有抗性基因，导致缺乏标记基因。2.基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取途径：（2）基因表达载体的构建重组质粒的构建：表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点。启动子和终止子：启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的位点。基因表达载体的构建过程：（3）将目的基因导入受体细胞转化：导入方法因受体细胞的种类不同而异：转化的实质：目的基因导入受体细胞染色体基因组中并表达和发挥作用。（4）目的基因的检测与鉴定：导入检测：DNA分子杂交技术（使用DNA探针）。个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等的接种实验。【热点考向1】 基因工程的基本工具高考频次3年18考 预测指数 【典题训练1】（2010江苏高考）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题： （1）图1所示的一个质粒分子经Sma切割前后，分别含有_个游离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越_。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是_。（4）与只使用EcoR 相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_。（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体中，然后在_的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。【规范答题】（1）生物术语要规范，用词要准确。（2）分析图示要到位，注意限制酶的作用位点的差异。（3）解答最后一题时要明确选择培养基在基因工程中的作用。【解析】本题考查基因工程中的限制酶的作用特点。（1）质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出，质粒上只含有一个Sma的切点，因此被该酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团。（2）由题目可知，Sma识别的DNA序列只有G和C，而G和C之间可以形成三个氢键，A和T之间只可以形成两个氢键，所以Sma酶切位点越多，热稳定性就越高。（3）质粒上抗生素抗性基因为标记基因，由图2可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有Sma酶切位点，都可以被Sma破坏，故不能使用该酶剪切质粒和外源DNA。（4）只使用EcoR，则质粒和含目的基因的外源DNA两端的黏性末端相同，用连接酶连接时，会产生质粒和含目的基因的外源DNA自身连接物，而利用BamH 和Hind 剪切时，质粒和含目的基因的外源DNA两端的黏性末端不同，用DNA连接酶连接时，不会产生自身连接产物。（5）质粒和目的基因连接后获得重组质粒，该过程需要连接酶作用，故混合后加入DNA连接酶。（6）质粒上的抗性基因为标记基因，用于鉴别和筛选含有重组质粒的受体细胞。（7）将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，含有重组质粒的个体才能吸收蔗糖，因此可利用蔗糖作为唯一碳源的培养基进行培养受体细胞，含有重组质粒的细胞才能存活，不含有重组质粒的因不能获得碳源而死亡，从而达到筛选目的。满分答案：（1）0、2 （2）高（3）Sma会破坏质粒中的抗性基因和外源DNA中的目的基因（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化（5）DNA连接（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞（7）蔗糖为唯一含碳营养物质【热点考向2】 基因工程的应用高考频次3年12考 预测指数 【典题训练2】（2011海南高考）回答有关基因工程的问题：（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后，使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_（相同，不同）黏性末端的限制酶。（2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用_处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作为探针与mRNA杂交，该杂交技术被称为_。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成_，常用抗原-抗体杂交技术。（3）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的_中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的_上。【规范答题】（1）生物术语规范：平末端、RNA聚合酶、DNA-RNA分子杂交技术、T-DNA。（2）审题规范：第（2）小题中“为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA”，实质是检测的第二步，需用“分子杂交技术”，而不是“DNA分子杂交技术”；第（3）小题中通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的部位是“染色体”一定要准确。【解析】（1）限制酶切割DNA可以产生黏性末端和平末端。一般同一种限制酶切割目的基因和质粒，产生相同的黏性末端。（2）基因表达载体中启动子是RNA聚合酶特异性识别并结合的位置，驱动基因转录。用大肠杆菌作为受体细胞时，要用Ca2+处理，以利于表达载体进入。检测目的基因是否转录，可用分子杂交技术，检测目的基因是否表达出蛋白质，可用抗原抗体杂交技术。（3）目的基因插入农杆菌质粒DNA上，然后插入植物细胞的染色体上。满分答案：（1）平 相同（2）提供RNA聚合酶特异性识别和结合位点，驱动基因转录Ca2+DNARNA分子杂交技术胰岛素（蛋白质）（3）TDNA 染色体【热点考向3】 细胞工程高考频次3年8考 预测指数【典题训练3】（2011天津高考）絮凝性细菌分泌的具有絮凝活性的高分子化合物，能与石油污水中的悬浮颗粒和有机物等形成絮状沉淀，起到净化污水的作用。为进一步提高对石油污水的净化效果，将絮凝性细菌和石油降解菌融合，构建目的菌株。其流程图如下。据图回答：（1）溶菌酶的作用是_。（2）PEG的作用是_。（3）经处理后，在再生培养基上，未融合的A、B难以生长。图中AB融合菌能生长和繁殖的原因是_。（4）目的菌株的筛选：筛选既能分泌具有絮凝活性的化合物，又能在含有_的培养基上生长的AB融合菌，选择效果最好的作为目的菌株。（5）为探究目的菌株不同发酵时间发酵液的絮凝效果，将目的菌株进行发酵培养，定时取发酵液，加入石油污水中：同时设置_为对照组。【规范答题】（1）生物术语规范：分解细胞壁、诱导原生质体融合。（2）审题规范：流程图表示的是将絮凝性细菌和石油降解菌融合构建目的菌株的过程，而细菌具有细胞壁，因此融合之前必须去掉细胞壁，这样就明确了溶菌酶的作用。（3）作答规范：第（3）小题中要回答出两个方面的原因，即未融合的A、B难以生长，图中AB融合菌能生长和繁殖的原因；第（5）小题注意该实验的目的是探究目的菌株不同发酵时间发酵液的絮凝效果，故需要设置不加发酵液的石油污水作对照。【解析】（1）由于细菌具有细胞壁无法完成细胞融合，所以需要用溶菌酶去除其细胞壁。（2）PEG为聚乙二醇，其作用是诱导原生质体融合。（3）未融合的A、B失活部位不同，即活性部位不同，不能在培养基上生存，而融合后的细菌活性部位互补则能生存。（4）由题意可知，目的菌株是将絮凝性细菌和石油降解菌融合后建立的，因此该菌株既能分泌具有絮凝活性的化合物，又能在含有石油的培养基上生长。（5）该实验的目的是探究目的菌株不同发酵时间发酵液的絮凝效果，故需要设置不加发酵液的石油污水作对照，从而确定目的菌株的絮凝效果。满分答案：（1）分解细胞壁（2）诱导原生质体融合（3）两亲本失活部位不同，融合后活性部位互补（4）石油（5）不加发酵液的石油污水1.（2012浙江高考）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是（ ）A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再扩增基因BB.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花的矮牵牛的基因文库中获取基因BC.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞【解析】选A。具体分析如下：2.在高光强、高温和高氧分压的条件下，高粱由于含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其利用CO2的能力远远高于水稻。从高粱的基因组中分离出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Ppc基因），利用农杆菌介导的转化系统将其转入水稻体内，从而提高水稻的光合效率。下列说法错误的是（ ）A.在此过程中会用到限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体等工具B.此技术与花药培养技术相结合，可以快速获得纯合子，缩短育种周期C.Ppc基因导入受精卵是此技术的关键，否则不能达到该基因在各组织细胞中都表达的目的D.此项技术是否成功必须测定转基因植株与对照植株同化二氧化碳的速率【解析】选C。该基因与二氧化碳的利用有关，植物利用二氧化碳是在叶绿体中，因此该基因可导入叶绿体中进行表达，提高对二氧化碳的固定能力。3.（2011江苏高考）关于现代生物技术应用的叙述，错误的是（ ）A.蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质B.体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体C.植物组织培养技术可用于植物茎尖脱毒D.动物细胞培养技术可用于转基因动物的培育【解析】选B。蛋白质工程是通过对基因进行一定程度的改造，进而合成新的蛋白质，以合乎人们的需求；植物组织培养中，由于茎尖几乎不含或少含病毒，因此可以培育出无病毒植株；在转基因动物的培育过程中，可利用动物细胞培养技术，使获得外源基因的受体细胞增殖。B项中的体细胞杂交技术，目前指植物体细胞杂交，克隆动物和单克隆抗体的制备过程中不涉及该技术。4.（多选）在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作正确的是（ ）A.用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸B.用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C.将重组DNA分子导入原生质体D.用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞【解析】选B、C、D。本题考查基因工程的有关知识，基因工程的一般过程：用限制性核酸内切酶切割含目的基因的DNA分子（抗除草剂基因）和载体（质粒），用DNA连接酶连接切割好的目的基因和载体，重组DNA分子导入受体细胞，因为是植物可以说是原生质体，用相应的试剂和病原体筛选转基因细胞，用植物组织培养技术培养抗除草剂的转基因烟草（表达）。5.（2012江苏高考）图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp、BamH、Mbo、Sma4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请