凝固酶阴性葡萄球菌致病性分子标志物的建立与应用姜美娟姜美娟中国人民解放军第中国人民解放军第401401医院医院 11、立题依据u凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）广泛存在于人体皮肤、黏膜等组织表面，常在血液、痰液、尿液、深静脉 置管等各种标本中检出。文献报道，1995-1996年美国48个医学中心2596份 血标本中， CoNS的分离率达32.2%。尽管血液等无菌体液培养出CoNS临床意义较大， 但据报道单次血培养CoNS污染的可能性仍高达85%。第一部分 研究背景和意义2u近年来由于介入性诊疗操作、免疫抑制剂及广谱抗生素 的广泛使用，CoNS已成为院内感染的重要病原菌，而且耐药菌株比金黄色葡萄球菌更为多见。叶联华等报道人工瓣膜术后心内膜炎中，约有40%- 50%由凝固酶阴性葡萄球菌引起；2009年中国CHINET细菌耐药监测结果MRCoNS检 出率平均为71.7%,大于MRSA的52.7%。研究背景和意义3uCoNS 作为皮肤黏膜定植菌，在越来越多的标本中被 分离出来，常常引起临床困惑。其是否能作为感染的 病原菌是临床关心的问题。u有鉴于此，实验室建立对CoNS污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是临床明确诊断和制定合理治疗方 案的重要前提 。研究背景和意义4CoNS致病物质u在 CoNS 感染的发病过程中，细菌先黏附继而形成难以清除的生物膜是其最为重要的致病机制 ；u其中CoNS产生的多糖胞间黏附素（polysacchatide intercellular adhesion，PIA）是细菌生物膜形成聚集阶段所必需的物质，在感染过程中起重要的作用，是鉴定 其致病性的物质基础。u Heilmann 等发现 ica 操纵子对合成 PIA 以及在细菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。 研究背景和意义5ica 基因结构uica 基因座定位于细菌染色体，全长 3.4 kb，包括 icaR 调节基 因及串联存在的 icaA、icaD、icaB 和 icaC 结构基因。其中，icaADBC 4 个基因构成一个操纵子，可以通过检测 icaADBC 基因来反映ica 操纵子的存在。icaB 不直接参与胞间黏附素的合成,因为重组icaADC 就能 使细胞积聚； icaA 单独呈现低的N-乙酰葡糖胺转移酶活性； icaC涉及到把不断合成的多糖物质转运至细胞表面；生物膜的形成要求icaD编码的产物具有最佳活性。因此,我们选择了icaD 作为本试验的目的基因片段。研究背景和意义6u获得CoNS特异的致病性分子标志物；u确立敏感、准确、快速的医院感染相关性 CoNS特异基因诊断方法；u能够准确鉴定致病性与非致病性CoNS。研究背景和意义2、实验目的 7研究CoNS的生物标志物对该菌在医院获得性感染中的临床微生物学诊断与鉴定，追踪 传染源，探索其在医院感染中的确切作用和地 位、传播与感染规律，从而对控制传播途径、 建立准确有效的防治措施具有重要实际意义和 经济价值。研究背景和意义3、临床意义8u阴性对照：表皮葡萄球菌ATCC12228，购自中国 药品鉴定所，经基因组测序证明其ica操纵子缺失 ；u阳性对照：表皮葡萄球菌1-97-337，瑞金医院倪语 星教授惠赠，含有完整ica操纵子；u待测样本：自2006年1月至2007年9月，收集我院 临床各科室共114例疑是感染性标本。第二部分 材料和方法1、研究对象92、主要试剂u培养基： 哥伦比亚琼脂培养基、 刚果红琼脂 培养基、 LB肉汤增菌液。u引物：SodA引物 （ 5-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3 及5-ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC-3）；icaD引物 （5-AGGCAATA TCCAACGGTAA-3及5-GTCACGACCTTTCTTATATT-3）；16S rDNA 引物 （5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3及5-CCGTCAATTCCATTTRAG TTT-3）。 材料和方法103、主要仪器设备uPCR仪：PTC100 PCR仪，美国MJ Research Inc.；u恒压恒流电泳仪、电泳槽：DF-C型，北京东方特力科贸 中心；u凝胶成像系统：GDS8000 ，美国UVP Inc.； u核酸/蛋白定量仪：DU640，美国Beckman；u酶标仪：美国雷杜，深圳组装；uATB Expression：法国bioMrieux Inc；u生物安全柜：BSC-1500 B2，济南鑫贝西生物技术有限 公司；u全自动快速微生物培养检测系统：BacT/ALERT 3D 60， 法国bioMrieux Inc；材料和方法114、实验设计及方法标本采集阴、阳性对照菌种鉴定PIA检测PCR扩增icaD基因sodA基因 16SrDNA序列生物膜形成实验DNA测序、 生物信息学分析确定特征片段临床验证比较分析材料和方法12图图2.12.1： 部分样品刚果红试验结果341、刚果红试验第三部分 结果和讨论13表2.1: 114例CoNS的菌种组成及刚果红试验结果菌 种例数所占比例（ ）刚刚果红试红试 验验阳性刚刚果红试验红试验 各菌种阳性 率（）表皮葡萄球菌4741.21838.3溶血葡萄球菌4337.736.98人葡萄球菌119.6519.09木糖葡萄球菌32.630沃氏葡萄球菌21.750头头状葡萄球菌32.63133.3中间间葡萄球菌10.861100山羊葡萄球菌21.750缓缓慢葡萄球菌合计计21141.75100024结果和讨论14u刚果红试验通过培养48h后菌落的颜色变化来反映 CoNS 表达多糖胞间黏附素的情况，进而间接地反映其致病性。u114例样品中刚果红试验阳性率21.1%，由于CoNS分泌 的PIA在培养过程中可以丢失，使阳性结果偏低；另外，其方法学本身易于受多种因素影响，比如：蔗糖的浓 度、氯化钠和琼脂的浓度、气体条件等，干扰了实验结 果的正确性，不能满足临床要求。结果和讨论152、ica D基因片段的扩增 a b c d e f g20001000500250 (bp)图2.2 ：部分样品的icaD基因片段的 PCR 扩增结果结果和讨论16表2.2: 114例CoNS不同菌种icaD片段PCR扩增的结果 菌 种例数所占比例（ ）icaD片段 PCR阳性 结结果PCR实验实验 各菌种阳性 率（）表皮葡萄球菌4741.22042.6溶血葡萄球菌4337.7818.6人葡萄球菌119.65218.2木糖葡萄球菌32.630沃氏葡萄球菌21.750头头状葡萄球菌32.6266.7中间间葡萄球菌10.861100山羊葡萄球菌21.750缓缓慢葡萄球菌合计计21141.75100033结果和讨论17u通过设计icaD基因的特异性引物，对临床分离的114 株 CoNS进行PCR 循环扩增，29%（33/114）的菌株可以检 测到357bp 的icaD 基因产物；u 表明大部分 CoNS 不表达胞外多糖，无致病性，或者临 床分离的绝大部分 CoNS 可能是低毒性，源于正常菌群的污染。u采用 PCR 技术对 ica 操纵子结构基因片段进行扩增，可 以准确、快速地鉴定CoNS中致病性与非致病性的葡萄球菌，从而对临床凝固酶阴性葡萄球菌的正确诊断和合理 治疗提供实验室依据，有重要的临床意义。结果和讨论18图2.3 : 部分样品的定性黏附性实验结果3、体外黏附性实验结果和讨论19表2.4 : 9例icaD（ + ）菌株半定量黏附性实验结果实验实验 分类类实验实验 例 数黏附实验实验 阳性黏附实验实验 阴性ica D PCR（）， 刚刚果红红（）660ica D PCR（）， 刚刚果红红（）321合计计981结果和讨论20u通过体外半定量黏附实验测得88.9%（8/9） icaD（ + ）菌株是粘附株。u可见以半定量黏附试验结果作为生物膜形成能 力的判定标准，ica 操纵子的存在与CoNS粘附及其生物膜形成密切相关。u体外黏附性实验用光吸收原理检测生物膜成分 ，但生物膜本身的结构会受到破坏；且由于方 法比较复杂，需要严格控制实验条件才能获得 较好的重复性，不适合临床常规应用。结果和讨论214、16S rDNA及sodA基因片段扩增a b c d e 20001000500100 (bp)图2.5：部分样品的16S rDNA片段 PCR扩增结果 结果和讨论22图2.6： 部分样品的sodA 片段PCR 扩增结果a b c d e 20001000500250 (bp)结果和讨论23图7： 部分样品sodA PCR扩增产物的测序图谱结果和讨论24u 37例CoNS样品进行了16S rDNA基因及sodA基因片段的PCR扩增，电泳检测结果显示全部样品均能准确 地扩增出相应的片段，其片段大小分别为16S rDNA 926bp及sodA 482bp，且均为单一条带；u序列测定表明所有样品16S rDNA 及sod A PCR产物序列均相同，未发现与感染相关的特异性分子序列。结果和讨论25uica操纵子可出现在多种CoNS中，临床实验室 建立并常规进行CoNS致病性分子标志物的检测方法是有意义、有必要的；u通过本实验我们确立了的敏感、准确、快速的 医院感染相关性CoNS基因诊断新方法，即ica D基因扩增方法；第四部分 结论26结论u本研究首次报道了除表皮葡萄球菌以外的其 他种的凝固酶阴性葡萄球菌产生多糖胞间粘 附因子的情况；u表皮葡萄球菌在临床CoNS中检出最多，是携 带icaD操纵子的主要菌种，其致病性应引起 足够重视；27结论u16S rDNA以及sod A基因可作为鉴定CoNS的基因标记，但不能用来作为致病性与非 致病性凝固酶阴性葡萄球菌的鉴别依据。u目前区分致病性与非致病性凝固酶阴性葡 萄球菌的基因标志仍是串联存在的ica D基因片段，其可被认为是获得性医院感染相 关性CoNS特异的基因型或基因标志物。2829