江西省血液中心核酸检测经验介绍钱 榕主要内容o 中心简介o 核酸检测实验室的设置及工作流程o 核酸检测实验室管理和检测关键控制点o 开站核酸检测情况江西省血液中心概况江西省血液中心于1984年成 立，隶属省卫生厅管理的公共卫 生事业单位。占地面积63.4亩， 总建筑面积21788,现有职工 171人，供应省直13家医疗机构 临床用血，2011年总供血量为 23.8吨，并承担全省采供血机构 质量控制与评价、业务技术指导 、人才培训及血液相关的科研等 任务。自2006年起，临床用血已 实现100%来自于自愿无偿献血。 成分输血达到99.8%。 p 中心重视科研工作，致力从临床输血治疗和开展新 技术治疗的需求出发，开展了血液去除白细胞、血 浆病毒灭活等新技术。2010年4月份，中心与北京、 上海、广州等12个省市15所采供血机构一道，被卫 生部列为我国内地首批核酸检测试点单位。此外， 中心先后开展了骨髓移植配血、器官移植配型(基因 法)、产前血型血清学检测、新生儿溶血病检测、亲 子鉴定(基因法)等研究工作。 中心核心价值观忠诚履行输血使命精益服务健康人生中心环境o标本交接离心区：用于核酸标本的接收、离心处理；设备：大容量低温离心机2台o混样区：用于血液标本开盖、混样、以及质控品的加样；设备：全自动混样仪HAMILTON STARIVD 2台、生物安全柜1台 、 移动紫外车3台；o提取扩增检测区：用于核酸的提取、PCR扩增和检测。设备：3套 COBAS AmpliPrep+COBAS TaqMan 、服务器1台 、试剂暂存冰箱1台、移动紫外车3台核酸检测实验室的设置核酸检测实验室的设置实验室平面图 o 检测系统：cobas s 201核酸血液筛查系统 o 设备配置：2 STAR+ 3CAP+ 3docking+ 3CTM o 试剂组成：cobas TaqScreen MPX Test（96人份，一代）cobas TaqScreen MPX Control Kit（一代：6*6）cobas TaqScreen Wash Reagentp 全血标本标本采集后4小时内进行离心处理。样本离心后先进行常规酶 免检测，然后将酶免试剂阴性结果标本进行六混样核酸检测。 如混样检测有反应性，再进行拆分检测。 o 机采标本标本采集后4小时内进行离心处理；加样模式：六混样（1机采标本+5全血标本）核酸检测实验室工作流程核酸检测检测（酶免第一批阴性）23.0008.0009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.0020.0021.0022.00核酸检测检测（酶免第二批阴性）核酸检测检测（酶免第三批阴性）酶免检测检测第一批2 staffsStart NAT酶免检测检测第二批酶免检测检测第三批核酸检测如有阳性结果，当天进行拆分实验核酸检测实验室工作流程核酸检测检测阳性样样本拆分实验实验03.0004.0006.0019.0020.0021.0022.0023.0024.0001.0002.001 staff05.0007.00全部样本在48小时内出报告，符合卫生部核酸检测要求核酸检测实验室工作流程核酸检测的关键控制点标本p 采血管的选择 p 留样方式及注意事项 p 运输过程中标本质量保证 p 标本处理方式及细节解读 p 标本检测核酸检测采血管的要求p 抗凝剂：首选EDTA和枸 橼酸盐，避免使用肝素 抗凝。 p 无菌 p 无DNA酶、无RNA酶： p 含分离胶的真空采血管 ；标本留取细节解读p 防污染留取人员的个人防护，留取前的清洁消毒，留 取过程中保持密闭，防止其他可能污染物。 p 充分混匀注意样品采集后的充分混匀，一般上下颠倒 次以上，如操作不规范，则容易出现凝块，给后续 检测带来弊端：核酸检测出现凝块报错，引起人力 、试剂等不必要的浪费，增加标本污染风险。 p 标本量标本留取应检查是否足量，如量少，应更换采 血管重新留取，杜绝开盖留取。NAT标本溶血及影响p 溶血：原因多为标本留取中机械作用致红细胞破 裂引起，如标本留取不畅、留取速度过快等；另 外，剧烈震荡也可引起溶血，如运输颠簸等 p 溶血对NAT检测的影响：血红蛋白是核酸检测的主要抑制物之一，可抑 制核酸检测；另外可核酸酶的释放加速核酸降解 。 p 如何避免溶血现象出现？标本留取时将血液顺管壁缓慢注入真空管中；另 外避免震荡，以防血细胞破裂而溶血。 NAT标本脂血及影响 脂血是指血液标本采集后，经过离心处理， 分离出来的血清中含有脂类物质。从外观上 看，血浆呈浑浊的乳白色。 脂血对NAT检测的影响：脂血易引起加样环 节液面感应异常报错；高脂血标本可通过对 荧光的屏蔽和吸收作用而干扰检测。 如何避免留取脂血标本？应注意饮食情况等的征询，可一定程度消除 留取脂血标本。NAT标本中的其它影响因素 内源性：免疫球蛋白、蛋白酶、离子等； 外源性：肝素抗凝剂、手套滑石粉、标本容 器或采样器材中含有的抑制物等。标本的运输冷链控制专用标本运输箱的使用；确保标本在采集后4小时内离心。核酸标本离心细节解读p 离心机的选择：低温离心机；p 离心条件：3000g,20min，应根据实际进行调整以 确保离心充分；p 另外，为更好的消除凝块，可在离心前再次颠倒混 匀；也可在检测前进行二次离心。检测前准备 检测前核对：状态、标识、离心时间、保存 条件等； 室温平衡：如标本在4中保存，检测前应 室温平衡30分钟以上（非常重要，否则易产 生clot）； 开盖：加样前开盖；在生物安全柜中进行；加样过程中凝块报错原因分析 采血后混匀不充分：局部抗凝效果不佳致凝块析出 ； 离心条件不充分：离心力或离心时间不足所致，如 血浆中存在的微量血细胞、分离胶、纤维蛋白等为 引发凝块的原始因素。 加样前室温平衡时间不足。 加样设备问题：为假凝块，多为设备感应异常、设 备硬件与软件的兼容性欠缺等原因引起，可通过调 整参数、软件兼容性等方法解决；核酸标本的采集、运送、处理和保存 的关键点 采血管：抗凝剂、一次性密闭、无菌、无核 酸酶及其他扩增抑制物 采集：人员、防污染、采集方式 标本的运送：冷链控制？尽可能快？ 标本的处理：离心时间、离心强度，4小时 内离心 合格标本:外观质量符合要求、容器完整、 量够、核酸检测的关键控制点防污染措施核酸检测的最大特点是具有强大的扩增能 力与极高的灵敏度，这也意味着极其微量 的污染即可造成假阳性结果。易引发NAT检测污染的几个环节o 标本的开盖oNAT检测试剂、外部质控品的准备o 扩增产物的处理o 用品的专用与清洁（如手套、纱布等），基因扩增实验室管理办法规定：在核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致 的污染为避免样本间的交叉污染，加入待 测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。Roche cobas s 201系统防污染设计全球唯一的三重防污染设计仪器：全自动封闭系统反应管：全程封闭状态，杜绝交叉污染试剂：专利的UNG酶消除扩增产物带来的污染p移动紫外灯照射； p70%乙醇；日常仪器和架子的维护清洁p新鲜配置的0.5%次氯酸钠溶液；实验室工作台面和样本外溅时使用 p实验室通风其他实验室防污染措施p温度在15-30度之间，超出这个范围仪器报警 ；p注意除湿，湿度不宜超过60%，超过这个湿度 仪器故障率高。核酸检测的关键控制点温度与湿度核酸检测实验室检测管理p 严格单向工作流向制度进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即：试 剂贮存和准备区标本制备PCR扩增产物分析；各区在物理空间上完全互相独立，使用功能上互相分 割；各区之间不能有空气直接相通。 p 严格物品专用制度各区使用的仪器设备、移液器、Tip、试管架、笔记 本、记号笔、手套等包括清洁用物品都必需执行专区 专用原则。各工作区域用品必须有明确的标记，避免不同工作区 域内的设备、物品混用。 p 分区内操作流程的合理化 了解实验室污染的来源，可能产生污染的实验操作 （如阳性样本、实验过程中每一次的开盖过程等） 操作顺序应尽量从相对清洁到相对污染（如混样区 相对清洁度：检测耗材标本阳性质控品),操作顺 序颠倒时应及时更换手套或进行相应的处理； 养成良好的实验室操作习惯，规范行为。 p 避免携带污染 操作人员应注意防止通过头发、眼镜等非专用物品 将污染物携带到清洁区； 警惕手套可能接触污染物或污染其它物品等。p 2010年8月9日-2013年7月31日共完成177916份血 液标本的核酸检测。其中拆分检测586次；拆分出 390例酶免阴性而NAT阳性的标本，阳性率为0.22% 。p 鉴别阳性标本190例，其中188例为HBV阳性，另有1 例HBV、HCV合并感染,1例HCV阳性。血站开展核酸检测情况检测常见现象分析o问题1：初混阳性，拆分阴性标本如何解释？因根据检测CT值、扩增曲线等综合判断，一般CT值在37以 上可考虑为初混时产生了假阳性反应，因拆分实验所检测的样 本量要高于混样，拆分检测可信度高于初混检测，对于拆分实 验为阴性的标本可视为合格标本，o问题2：拆分为阳性，鉴别试验阴性，如何解释？原因分析：标本病毒含量极低，因此在病毒载量系统上检测无 结果；其次，对于极低浓度样本，其取样也存在随机性，不能 够保证每次取样都能吸取到含有病毒的部分。建议：对于拆分检测阳性标本，无论其鉴别试验结果如何，有 必要进行血液报废处理。