1趋化因子受体 CCR5 胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定【关键词】 因子Cloning, expression, purification and identification of CCR5 extracellular domain recombinant protein【Abstract】 AIM: To construct a prokaryotic expression vector of CCR5 extracellular domain recombinant protein and to purify and identify it. METHODS: To obtain amino acid sequence of CCR5 extracellular domains, the four peptides of CCR5（Nterm, ECL1, ECL2 and ECL3） were combined using the soft linker and named rCCR5. RCCR5 gene was synthesized according to codon E.coli preferred. The gene was cloned into the vector pET22b（+） and the aim protein was expressed in E.coli. The expression product was purified and then identified with Westernblot. RESULTS: We developed a purification process of rCCR5 from inclusion bodies. The procedure included washing and solubilization of inclusion body, purification by SephacrylS300 and refolding by SephacrylS100. The result of Western blot showed the 2specific binding of CCR5 mAb with aim protein. CONCLUSION: Purified recombinant protein rCCR5 is obtained successfully, which can be used as a candidate antigen for CCR5 autovaccine to challenge HIV1 infection.【Keywords】 CCR5; PADRE; inclusion bodies; refolding; autovaccine; HIV1 infection【摘要】 目的：构建趋化因子受体 5(CCR5)胞外段重组蛋白(命名为：rCCR5) 原核表达载体，并进行诱导表达. 对表达产物进行纯化和鉴定. 方法：截取 CCR5 胞外结构 4 个片段 NTerm，ECL1, ECL2 和 ECL3 的氨基酸序列，应用柔性 linker 分别串联，模拟CCR5 胞外结构，依据大肠杆菌偏爱密码子人工合成基因 . 运用基因重组方法在大肠杆菌中进行表达,表达产物经纯化、复性后进行Western blot 鉴定. 结果：目的蛋白以包涵体形式存在，经包涵体洗涤、变性溶解，SephacrylS300 凝胶过滤层析及 SephacrylS100凝胶柱复性获得了纯化的蛋白质，目的蛋白能与 CCR5 mAb 特异性结合. 结论：获得了大量纯化的 rCCR5 重组蛋白，可作为研制CCR5 自体蛋白疫苗以阻断 HIV1 感染的候选抗原蛋白.【关键词】 CCR5;人工手动 HTL 表位；包涵体;复性;自体疫苗;HIV1 感染30 引言趋化因子受体 5(CCR5)是 HIV1 感染初期病毒进入体内最重要的辅助受体1 ，近几年来，以 CCR5 为靶点的抗 HIV1 策略倍受关注，通过小分子拮抗剂、单克隆抗体及基因干涉等不同手段减弱或降低细胞表面 CCR5 的功能达到对抗 HIV1 感染的目的2-5 . 其中以 CCR5 为靶向的自体疫苗开辟了艾滋病疫苗研究的新途径 6. CCR5 自体疫苗通过诱导机体自身产生针对自身分子 CCR5 的抗体进而与细胞表面的 CCR5 结合，降低细胞表面的 CCR5 的数量，减少了 HIV1 病毒感染的机会，达到预防 HIV1 感染的效果. 我们构建人 CCR5 胞外段重组蛋白表达载体，对获得的重组蛋白纯化、复性 . 为构建 CCR5 自体蛋白疫苗提供实验依据.1 材料和方法1.1 材料各种限制性内切酶、T4DNA 连接酶（TaKaRa 公司） ； DL2000 DNA marker（大连宝生物工程公司） ；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒（上海博亚生物技术有限公司） ；蛋白 marker 羊抗鼠二抗（华美公司） ；小鼠抗人 CCR5 mAb（ R&D 公司）. 其他试剂均为国产分析纯. 原核表达载体 pET22b(+)质粒为本室保存. 宿主菌为大肠杆菌 BL21. 5L 发酵罐（B. Braun 公司）. 4 高速离4心机、冻干机（Beckman 公司）. 凝胶柱填料 SephacrylS300， SephacrylS100 及纯化设备（Amersham Pharmacia Biotech 公司）.1.2 方法1.2.1CCR5 胞外段基因的合成分析 SwissPro 蛋白质数据库CCR5 的结构，截取 CCR5 胞外 4 个片段 NTerm,ECL1,ECL2,ECL3的氨基酸序列，分别为NTerm:MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAAR(31)；ECL1：YAAAQWDFGNTMCQ(14)；ECL2:RSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLK(30)；ECL3:NTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAM(22). 应用柔性 linker（氨基酸序列为 GGGGS）分别串联，获得模拟 CCR5 胞外片段的氨基酸序列(命名为： rCCR5)，按照已公布的人 CCR5 的基因序列，于5端插入 Nde酶切位点,3端引进终止密码子 TGA 并插入 Sal酶切位点，依据大肠杆菌偏爱的密码子，送交上海生工生物技术公司合成目的基因.1.2.2pET22b(+)/rCCR5 表达载体的构建将含有合成目的基因的质粒 pUC57 经 Nde和 Sal 双酶切后，回收 360 bp 左右的小片段，同时用 Nde和 Sal双酶切 pET22b(+)，回收大片段. 建立5连接体系，16连接过夜. 连接产物转化感受态 DH5 细胞，提取质粒，经酶切鉴定和 DNA 测序正确后获得含有 rCCR5 基因原核表达载体，命名为 pET22b(+)/rCCR5.1.2.3pET22b(+)/rCCR5 原核载体的表达 pET22b(+)/rCCR5 转化感受态 BL21 细胞，挑取含重组表达质粒的大肠杆菌 BL21 单菌落并接种于 5 mL 含 100 mg/L 氨苄青霉素（ Amp）的新鲜 LB 培养液中, 37摇床培养过夜, 次日以 1100 接种于含 100 mg/L Amp的新鲜 LB 培养液中, 37 继续培养至细菌密度达到 A600 nm=0.40.6, 1 mmol/L IPTG 诱导，4 h 后收菌，小规模培养及诱导后离心收集菌体, SDSPAGE 检测目的蛋白的表达和存在形式.1.2.4 工程菌的发酵从活化的 LB 平板上挑选单菌落接种于含 LB的试管中, 37培养 10 h,转种至含 200 mL LB 的三角瓶中, 37 培养过夜. 次日将种子液接种于 5 L 发酵罐. 控制发酵温度 37 ，转速 250450 r/min、通气量 35 L/min，pH 7.3. 培养至 A600 nm=8 时,1 mmol/L IPTG 诱导，继续培养 4 h,终止发酵,收集菌体、称质量，-20 冰箱保存备用 . 取少量菌体处理后用 SDSPAGE 检测目的蛋白的表达.1.2.5 目的蛋白包涵体的分离和洗涤取 10 g 发酵菌体, 按 1 g 湿菌质量对 7 mL 的比例 , 用裂解缓冲液 STE (50 mmol/L TrisHCl, 6pH 8.0, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA)重悬, -20 过夜. 次日于室温水浴中融化, 溶菌酶法裂菌， 400 W 超声破菌，其中超声5 s,间隔 10 s,共进行 100 次. 12 000 g 4离心 20 min,弃上清, 沉淀用包涵体洗涤液 A(10 mL/L Triton X100, 1 mmol/L EDTA, 10 g/L DOC， 50 mmol/L TrisHCl，pH 8.5, 100 mmol/L NaCl)重悬, 12 000 g 4离心 20 min, 弃上清. 再用包涵体洗涤液 B（50 mmol/L TrisHCl， pH 8.5, 2.5 mol/L 尿素,100 mmol/L NaCl, 5 mmol/L 巯基乙醇,1 mmol/L EDTA ）重复洗涤 3 次, 直至离心后的上清液澄清为止. 最后用包涵体洗涤液 C(50 mmol/L TrisHCl， pH 8.5, 1 mmol/L EDTA)洗涤 1 次后离心，离心条件不变.1.2.6 表达产物变性条件下的纯化经洗涤的包涵体以 100 g/L 溶于缓冲液（50 mmol/L TrisHCl， pH 8.5, 5 mmol/L 巯基乙醇,1 mmol/L EDTA, 8 mol/L 尿素）中, 4搅拌过夜, 12 000 g 4离心 30 min, 收集上清, 即为目的蛋白粗提液 . SephacrylS300 凝胶柱为 1.6 cm80 cm, 以工作液(8 mol/L 尿素, 50 mmol/L TrisHCl， pH 8.5, 1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl) 充分平衡后, 目的蛋白粗提液 2 mL 上柱, 以工作液洗脱, 流速 1 mL/min, 分步收集并测定蛋白质含量, 以 SDSPAGE 确定目的蛋白所在位置, 收集纯度较高的洗脱组分.1.2.7 表达产物的复性以工作液(50 mmol/L TrisHCl, 1 mmol/L 7EDTA，100 mmol/L NaCl， pH 8.5)充分平衡后,取SephacrylS100 凝胶(1.6 cm60 cm)过滤目的蛋白样品，用SephacrylS300 凝胶柱工作液调整蛋白样品浓度为 20 g/L,用蛋白复性液(50 mmol/L TrisHCl, 1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1.25 mmol/L GSH, 0.25 mmol/L GSSG, pH 8.5)洗脱，流速 0.5 mL/min,分部收集, 测定蛋白质含量, SDSPAGE 确定目的蛋白所在位置, 收集纯度较高的洗脱组分, 目的蛋白洗脱峰直接对水透析，4 ，24 h，其中换液 3 次 . 透析后样品于 4，12 000 g/min 离心 30 min，冻干上清，收集样品 . HPLC 检测蛋白纯度.1.2.8 表达产物 Western blot 鉴定目的蛋白经 SDSPAGE 转移至硝酸纤维素膜,以 10 g/L BSA 室温封闭过夜后,用小鼠抗人 CCR5 mAb(11000 稀释) 孵育膜,室温 3 h，TBST 洗膜 310 min,再以HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 抗体(11000 稀释) 孵育膜, 室温 3 h; TBST 洗