实验三 凝胶过滤法使蛋白质脱盐山东师范大学生命科学学院生物化学实验之【实验原理】凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或凝 胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的大小和 形状，即蛋白质相对分子质量进行分离和纯化。该方法广泛用于生物大分子的分离、纯化、 浓缩等。【实验目的】学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原 理与操作技术凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶 性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂 糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据 多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同 的排阻效应实现的。葡聚糖凝胶的商品名称为 Sephadex，它具有三维空间的 多孔网状结构，呈珠状颗粒。 本实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当 蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的 (NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中，而大分子的 蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻 在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分 子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动 ，首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩 散进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受 到阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白 质与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白 质样品脱盐的目的。凝胶过滤层析过程示意图【器材与试剂】（一）器材1. 层析柱(15mm300mm） 2. 铁架台3. 滴定管夹 4. SephadexG25 5. 刻度吸管 （二）试剂1. 样品溶液蛋白质硫酸铵溶液2.10黄柳酸3.钠氏试剂4.洗脱液（去离子水）【实验操作】（一）凝胶的溶胀取Sephadex G25， 加入去离子水置室 温溶胀 24小时以上，反复倾 泻去掉细颗粒， 或沸水浴中煮沸 23小时，可去除颗粒内部的空 气及灭菌。（二）连接层析装置1. 先将层析柱垂直固定在铁架台上。2. 按下图将各部位连接起来。洗 脱 液连 接 软 管层 析 柱收 集 容 器连 接 软 管（三）装柱与层析1.装柱向层析柱中注入少量洗 脱液（去离子水），将凝胶 浆液沿玻棒缓慢倾入柱中（ 注满）。凝胶自然沉积约1 2cm 高度后打开下端出水 口,待凝胶床面上升到约3/4 柱高停止。关闭出水口,静 置。2.洗柱通过细乳胶管小心地将烧杯中的洗脱液与层析柱接通，然后拧松螺旋夹，让洗脱液滴下冲洗 层析柱，以除杂质并使柱床均匀密实（此步也称 作平衡）。适当时间后（流下的洗脱液体积一般 为柱床体积的23倍），再拧紧螺旋夹。洗柱过程中注意调整流速约2ml/min。3.加样与洗脱用刻度吸管吸取1ml样品（蛋白质硫酸铵溶液），其尖头小心沿层析柱内壁伸到床面之 上，慢慢将样品加到凝胶床面上（不可搅动床 面），此时能看到床面上样品与洗脱液之间有 一清晰界面。拧松螺旋夹，待样品全部进入凝 胶柱中, 接通洗脱液，开始洗脱并收集洗出液。 用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。（1）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠 氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀。（2）取洗出液2滴置小试管中，加入磺柳酸 1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀出现。4.收集检查1）NH4+检查2）蛋白质检查