第四章 药物定量分析与 分析方法验证第一节 定量分析样品的前处理方法第二节 定量分析方法特点（自学）第三节 药品分析方法的验证第四节 生物样品分析方法的基本要求第一节 定量分析样品的前处理方法一、含卤素有机药物的分析一、概 述含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐。结构特点：CX（一）含卤素有机药物卤素与脂肪链的C原子相连者，卤素与C原子结合不牢固，可直接测定或水解后测定。氮芥 氟烷 1 卤素与脂肪链碳原子相连碘番酸 泛影酸 卤素与芳环相连的药物，卤素与碳原子结合牢固，不能直接进行测定，需经处理后才能测定。2 卤素与芳环碳原子相连碘苯酯I诺氟沙星磺溴酞钠（二）含金属的有机药物1. 含金属有机药物2. 有机金属药物 :金属原子直接和碳原子以共价键相连，结合牢固，溶液中一般不能解离成离子状态，需经有机破坏后分析。金属原子不直接和碳原子相连，以金属的有机酸及酚的盐或配位化合物的形式存在.如酒石酸锑钾、富马酸亚铁、葡萄糖酸锑钠等。富马酸亚铁 硫柳汞 卡巴胂二二 不经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法直接测定法经还原分解后测定法经水解后测定法( (一一) ) 直接测定法直接测定法 Fe2+ + Ce4+Fe3+ + Ce3+如：葡萄糖酸锑钠的含量测定 碘量法Sb5+I-Sb3+ + I2Na2S2O3滴定适用于金属原子不直接与碳原子相连的或CM键结合不 牢固的有机金属药物。（包括配位滴定、氧化还原滴定 ） 如：富马酸亚铁的含量测定 ChP(2005)铈量法邻二氮菲做指示剂，微过量的硫酸铈将红色亚铁配合物氧化成浅蓝色高价铁 。( (二二) ) 经水解后测定法经水解后测定法 1、碱水解后测定法适于卤素和碳原子结合不牢固的含卤素有机含卤素有机药物回流回流Volhard法银量法根据终点指示方法可分为： 1 莫尔法（Mohr法，铬酸钾指示剂法） 2 佛尔哈德法（Volhard法，硫酸铁铵指示剂法） 3 法扬氏法（Fajans法，吸附指示剂法）方 法指示剂滴定液被滴定物终点变化莫尔法K2Cr2O7AgNO3卤化物砖红色原理佛尔哈德法 硫酸铁铵NH4SCN(KSCN)Ag+红色法扬氏法吸附指示剂AgNO3卤化物指示剂变色例：十一烯酸锌的测定2、酸水解后测定法十一烯酸锌稀盐酸十一烯酸氧化锌EDTA-Na滴定( (三三) ) 经还原分解后测定法经还原分解后测定法 适用于碘原子与苯环直接相连的含卤素有机药物。NaOHZn +3Na2ZnO2+3H2O +3NaI+2CH3COONaNaI的测定CHPUSP（KIO3滴定法）AgNO3滴定冰HAC, 曙红钠指示剂（Fajans法 ）泛影酸三 经有机破坏的分析方法(一) 湿法破坏主要适用于含氮有机药物、生物制品分析中N、P等测 定的前处理u H2SO4-HNO3u H2SO4-HClO4u H2SO4-K2SO4u HNO3-KMnO4分解剂/消化剂辅助分解剂凯氏定氮法测定含有氨基和酰胺结 构的药物结构原 理将含氮药物与硫酸在凯氏烧瓶中共热，药物分子中有机结构被“消化”成CO2和H2O，有机结合的氮转 化为无机氮，与过量的硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵 ，经碱化后释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液 或定量的酸滴定液吸收后，再用酸或碱滴定液滴定。n 常量法含氮量 2530mgn 半微量法含氮量 1.02.0mg凯氏定氮法凯氏烧瓶K2SO4(提高消解温度) CuSO4(加快消解速度)硫酸碱液硼酸(吸收液) 甲基红-溴甲酚绿指示剂硫酸滴定 空白校正1.高温炽灼法用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。(二) 干法破坏氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的待测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据待测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。2 2 氧瓶燃烧后测定法氧瓶燃烧后测定法（Oxygen flask combustion methodOxygen flask combustion method）(1) 原理适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析(3) 特点：本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析(2) 适用范围：(4) 装置燃烧瓶：为500、1000或2000ml无 色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶瓶塞：空心，底部熔封铂丝一根铂丝：下端呈螺旋状或网状。固体样品 ： 无灰滤纸液体样品 ： 纸袋软膏类样品：蜡油纸中包裹后再用无灰滤纸包裹(5) (5) 操作方法操作方法 样品的准备取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。 燃烧前燃烧瓶的准备用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。 样品的燃烧点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，同法另做空白试验。(6) 吸收液作用：将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒 等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态。例 碘苯酯的含量测定 ChP 置换碘量法2 碘苯酯OI2NaIO + NaI1/3NaIO3 + 2/3NaI5/3NaI自身氧 化还原溴醋酸5/3NaIO32NaIO32HIO3 + 10KI + 12H+6 I2 +6 I2 + 12Na2S2O312NaI + 6Na2S4O6Br2（过量)+ HCOOH HBr（过量）+CO2 NaOH第三节 药品分析方法的验证 目的：证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。用途：1、药品质量标准起草时，分析方法需经验证。2、药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。验证内容 v 准确度v 精密度v 专属性v 检测限v 定量限v 线性与范围v 耐用性一 、准确度(Accuracy)1、定义：指测得结果与真实值接近的程度。通常采用回收率试验来表示。2、方法：v回收试验法（原料药）：空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为Mv 制剂可采用空白辅料中加入原料药对照品法。还应作单独辅料的空白测定。 v加样回收试验（中药） 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为MUV、HPLC 回收率要求在98102%范围容量分析法 回收率要求在99.7100.3%范围中药分析 回收率一般要求在95105%范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在90110%范围内。RSD一般在3%以内。数据要求 规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。（二）精密度(Precision)定义：系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之接近的程度。常用 标准差（SD）或相对标准差（RSD）表示。在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品，各测三次。或把被测物浓度当作100%，至少测6次计算RSD进行评价。1. 重复性同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。2. 中间精密度不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。3. 重现性指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力。是指该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。（三）专属性（specificity）氧氟沙星乳膏的含量测定图谱乳膏基质样品（四）检测限(limit of detection，LOD)1、定义：系指试样中被测物能被检测出的最低量。无需定量测定。常用%、ppm、ppb表示。它既反映方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白(本底)值的高低。2、方法：v 信噪比法（仪器分析方法）：HPLC、GC ：用已知浓度样品与空白试验对照，记录测得的被测药物信号强度S与噪音(或背景信号)强度N，以能达到SN2或SN3时的样品最低药浓为LOD；UV或荧光分析：多次空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差(即3空或3S空)作为检测限的估计v 目视法（非仪器分析方法）：通过已知浓度的样品，目视确定能被可靠地检测出的最低量作为检测限。（五）定量限(limit of quantitation，LOQ)1、定义：指在具有一定准确度和精密度的前提下，样品中被测物能被定量测定的最低浓度或量。常用%、ppm、ppb表示l 杂质和降解产物定量测定时需确定定量限。定量限与检测限的差别：定量限要定量测定某一药物在样品介质中的最低浓度，且定量限规定的最低浓度应该符合一定的精密度和准确度的要求。2、方法：v非仪器分析方法：与检测限的确定方法相同；v仪器分析方法：S / N=10时相应的浓度，作为定量限的估计值。（六）线性与范围(linearity and range)1、定义：v线性：在设计的范围内，测试结果与试样中被测 物浓度直接呈正比关系的程度。v线性范围：指达到一定精密度、准确度和线性的 条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间 。可用mgL mgL、gml ugml等表示。2、方法：线性与范围的确定可用作图法(响应值Y浓度X)或计算回归方程(Ya+bX)来研究建立。采用相关系数(r)表示标准曲线的线性度。对照品的LOQ必须包括在线性范围。（七）耐用性 (robustness)定义：指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。 变动因素：溶液稳定性、不同的测试耗用时间、不同的分析温度、不同的测定日期、流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等。 已有重现性验证，不需验证中间精密度如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充视具体情况予以验证准确度 精密度 重复性中间精 密度专属性 检测限 定量限线性/ 范围耐用性鉴别杂质定量杂质限度 含量测定溶出量测定检验项目和验证内容各种含量测定方法对效能指标的要求1. 容量分析法：用原料药精制品(含量99.5)或对照品考察方法的精密度，RSD 0.2；回收率一般在99.7100.3之间。2. UV法：用适当浓浓度的精制品进进行测测定，其RSD一般不大于1。制剂剂的测定，回收率一般应应在98102之间间。线性：吸收度A一般在0.30.7，浓浓度点n5。用浓浓度c对对A作线线性回归处归处 理，得一直线线方程，r应应大于0.9999(n5)，方程的截距应应近于零。3. HPLC法：要求RSD2，回收率98102之间。线性范围：浓度点n应为57，回归处理 浓度c 峰高H或峰面积A或被测物与内标的响应值之比进行回归，建立方程，r应大于0.999，截距应趋于零。思 考 题1、在原料药的分析方法验证中，是否所有指标均需进 行验证？2、怎样设计回收率试验？体内药物分析：是一门研究进入人或动物体内，存在于生物样品（如体液、组织、器官和排泄物等）中的药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学。一 概 述( (一一) ) 体内药物分析的概念体内药物分析的概念第四节 生物样品分析方法的基本要求（二）体内药物分析的意义通过体内药物分析结果可求得药物动力学参数，可了