Chapter9: High-level expression of foreign genes w1.gene silencew2. expression systems of foreign genew3.Isolating and purifying the product of foreign genes1.gene silence(基因沉默)wGene Silencing外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤， 但该基因不表达或表达量极低的现象。 . w Gene silencing can occur at either transcriptional level(TGS,Transcriptional Gene Silencing), or post- transcriptional level(PTGS, Post-Transcriptional Gene Silencing).wTGS: Methylation InducedRepeat-Induced Gene Silencing(RIGC), position effect ,and so onwPTGS: cosuppression, and so onMethylation InducedHistone:组组蛋白deacetylase去乙酰酰化酶 基因表达系 统原核生物基因表达系统：如大肠杆 菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、 链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等 。真核生物基因表达系统：如酵母表 达系统、植物细胞表达系统、昆虫 细胞表达系统、哺乳动物细胞表达 系统等。2. expression systems of foreign gene2. expression systems of foreign gene一、外源基因在原核细胞中的表达w欲将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下条件：w 通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并利用宿主菌的酶系统合成外源蛋白；w 外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA；w 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因的表达；w 外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(open reading frame，ORF)；w 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。（一） 基因表达的调控序列w对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉 及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列 。w1. 启动子w是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列。w大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（ consensus sequence）。w-35 Box 和 -10 BoxTTGACATATAATTranscriptional start site53-35-1016-19 bp5-9 bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45w原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的 启动子。为了表达真核基因，必须将其克 隆在原核启动子的下游，才在原核表达系 统中被转录。 w 最佳启动子必须具备的条件w 必须是一种强启动子w能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白 的10%-30%以上。w 应呈现低水平的基础转录w便于表达毒性蛋白等。w应是可诱导型的w用温度或化学试剂诱导。w（2）-35区与-10区之间的距离w间隔为17bp时，启动子最强。w（3） -35区和-10区的碱基顺序w越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）P tac = 3 P trp = 11 P lac启动子-35 区序列-10 区序列P lacT T T A C A T A T A A TP trp T T G A C AT T A A C TP tacT T G A C AT A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lLT T G A C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 启动子tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)w在原核生物表达系统中，通常使用的 可调控的强启动子有lac (乳糖启动 子)、trp (色氨酸启动子)、PL和 PR(噬菌体的左向和右向启动子)以 及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子) 等。 w2S-D序列 wmRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即S-D序列以及S-D序列与起始密码子AUG之间的距离。wS-D序列(AGGAGG)后面的4个碱基： w如果是A（T）, 翻译效率最高； w如果是G（C）,效率只有50%或25%。wSD序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基。多数情况下为7bp，此间的碱基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率。AUG左侧的三个碱基也有影响。 w-半乳糖苷酶的mRNA中： wAUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有 效； w如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。w3终止子w 在一个基因的3端或是一个操纵子的3，端 往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录 的功能，这一DNA序列称为转录终止子 (terminator)。 w 共同的特点，即有一段富含A/T的区域和 一段富含GC的区域，GC富含区域又具有回 文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有 茎环结构 。w在构建表达载体时，为防止由于克隆的外 源基因的表达干扰了载体系统的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强 的核糖体RNA的转录终止子。4、密码子的选择性w起始密码子：GUG 为 AUG 的 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。w主密码子：使用的频率高w罕用密码子：基因组中使用的频率较低。w如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的 主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之 则低。w构建表达载体时，要对外源基因的碱基进行适当置换， 或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整以适应宿主 细胞。（二）外源基因在大肠杆菌表达的形式w在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中w在细胞内表现为可溶性的蛋白质包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一 起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包 涵体。包涵体 的组成蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物：占大部分，具有正 确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵 体蛋白一般没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶 、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的 蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括 三个方面：折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；蛋白质折叠中间体的作用。w w 优点优点: :使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降 解、不损害寄主细胞w 缺点:回收的蛋白生物活性差。w分子伴侣共表达（一类能促使其他蛋白质按正 确的方式组装或折叠，本身却不是最终形成的 功能蛋白质的组成部分的多功能蛋白质）w硫氧还蛋白还原酶基因缺陷的寄主菌株w降低蛋白质的合成速率融合蛋白与非融合蛋白w不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白。 w 非融合蛋白(no-fusion protein)的优点在于表达产物的生物学功能更接近于生物体内天然蛋白质。非融合蛋白的最大缺点是容易被细菌蛋白酶所破坏。w融合蛋白(fusion protein)是将两个或多个基 因的编码区首尾连接,由同一调控序列控制构成的基因表达产物。w含原核细胞多肽的融合蛋白是避免细菌蛋白酶 破坏的最好措施。而含另外一些多肽的融合蛋 白则为表达产物的分离纯化等提供了极大的方 便。（三）外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位（三）外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位w细胞质中表达w周质中表达w优点： w容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。 w（2）信号肽（signal peptide）：能带领蛋白 穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。w（3）常用的原核信号肽w大肠杆菌的信号肽：wphoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、- 内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（ enterotoxin）ST-II、LT-B等w金黄色葡萄球菌的蛋白A。w枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶（ endoglucanase）。w胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。w（2）真核信号肽w鼠源RNase、人生长激素信号肽。w也能在细菌中起作用。3. 胞外表达w表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。w用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；w或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。w由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。1.非融合型 表达蛋白载 体pKK223-3 （四）几种（四）几种 类型的原核类型的原核 表达载体表达载体2分泌型克隆表达载体pin系统 作为分泌克隆表达载体中关键的编码信号肽的 序列，是取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa ( 外膜蛋白基因)。 3融合型蛋白表达载体pGEX系统w 这类载体与其他表达载体不同之处在 于S-D序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基 转移酶基因相连。当进行基因表达时，表 达产物为谷胱甘肽巯基转移酶和目的基因 产物的融合体。GST融合蛋白用 谷胱甘肽琼脂糖 (Glutathione Sepharose)亲和 层析柱分离纯化 。 产物分离柱（column） GST 外源蛋白凝血酶 外源蛋白柱（column） GSTGST洗脱 柱（column）可再利用原核细胞高效表达目标基因的战略w表达质粒的优化和设计w共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因w提高目标基因 mRNA 和目标基因产物的稳定性w优化发酵过程（五）原核细胞表达真核基因的缺陷 w没有真核转录后加工的功能，只能表达cDNA而不能表 达真核的基因组基因；w没有真核翻译后加工的功能，因而产生的蛋白质常没 有足够的生物学活性；w表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体wRNA聚合酶不能识别真核生物的启动子 w产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所 识别和降解 避免外源基因表达蛋白降解的对策：构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体 系统芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能将表 达蛋白分泌到细胞外。目前常用作基因表达系统的有枯草杆菌和短小芽孢杆菌等。v利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的优点： 许多芽孢杆菌是非致病性微生物，培养条件简单，生长迅速； 表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天 然构相和生物学活性； 某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作； 利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。1 芽孢杆菌表达载体复制子金色葡萄球菌的复制子：如pUB110、pC194和pE194等短小芽孢杆菌的复制子：如pHY481和pWT481等含金色葡萄球菌复制子的质粒表达载体在宿主细胞中 拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体DNA之间发生遗传重组。短小芽孢杆菌型复制子的质粒表达载体在宿主细胞 中的拷贝数较低，但能稳定存在于宿主细胞中，甚至在 没有抗生素选择压力下也不易造成质粒的丢失。表达载体自主复制质粒：是一类穿梭质粒，能在大肠杆菌中复制， 同时含有能在芽孢杆菌中复制的起始序列，因而也能在芽 孢杆菌中进行自主复制。整合质粒：在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽孢杆 菌进行复制的起始序列，因而不能