第四章 基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA粘粒（cosmid）与噬菌粒人工染色体载体载体的功能及特征载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。第一节 载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体 DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；具有筛选转化子的选择性标记基因；分子量小，拷贝数多；具有较高的外源DNA的载装能力；安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细 胞以外的其它生物细胞中。自主复制型载体和附加载体的扩增方式 载体的类型n应用范围：克隆载体、表达载体。n应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。n构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复 制子。表达载体(expression vector)使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可 将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。穿梭载体(shuttle vector) n又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。n同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。n主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。第二节 质粒质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；绝大多数的质粒是DNA型质粒常见于原核细菌和真菌中质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。 Plasmid chromosome 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA质粒质粒的基本特征1. 质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒 1 - 5 拷贝 stringent plasmid松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合oriE.coli ColE1 plasmid复制方向rop（+） RopRNA IIRNA I3553RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物 质粒 质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系质粒质粒的基本特征2. 质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成不相容性群。亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。质粒质粒的基本特征质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内(亲和性质粒)其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒质粒的基本特征 3. 质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。在基因工程应用的是重组缺陷型（rec）的质粒和菌株。质粒质粒的基本特征4. 质粒的重组性质粒质粒的基本特征5. 携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义利用抗性基因进行重组子的筛选质粒基因编码的特性nFertility /F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移 外没有其他功能。nResistance / R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因 。如RP4，发现于假单胞杆菌。nCol 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存 在于E. coli 中的CoE1。n降解质粒（Degradative plasmids）:可以降解特殊的分 子如：甲苯，水杨酸。n致瘤质粒（Virulence plasmids）：农杆菌Ti质粒。天然存在的两种质粒colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-30/cellpSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell，标记基因为Tcr质粒质粒的构建理想的质粒载体应具备的条件1.分子量较小。 2.松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。3.具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有一个强的选择标记。4.具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。5.能够导入寄主细胞，具备转化的功能。6.操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质粒载体。天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。质粒人工构建的目的质粒质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选质粒重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制 pBR322： 氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell用于基因克隆 优点：n分子量小：4363bp, 容易纯化。n含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而 且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA， amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基 因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。n受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。缺点：n有被动迁移的可能，不够安全。n抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。pBR322pBR322AmpAmpTetTet插入片段插入片段AmpAmp平板平板TetTet平板平板质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZpUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。pUC18的优点：1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。2) 重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不 必连接linker。4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插 入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和 体外定点突变。质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段a ab b5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal质粒重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743 bpMCSlacZ PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等在重组的 pGEM3Z载体中 加入相应的RNA 聚合酶，可以 发生外源基因 转录。质粒载体总体评价n操作简便n克隆容量有限（ 10kb）第二节 噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来。高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体的生物学特性： 生物结构l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的 ，可以缺失或被外源DNA片段所取代。l 噬菌体生物学特性： 生物结构5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COS COScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l - DNA黏性末端噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性： 感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性： 感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kb DA噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特