董文轩授课教师： 齐明芳陈俊琴现代园艺实验技术 本课程的主要目的本课程的目的是使学生掌握园艺作物成分检测与分 析方法的基础上，侧重培养学生对现代仪器分析方法的 原理理解和具体应用能力。 本课程的主要目标通过学习现代实验技术在园艺作物上的应用理论基 础，以及系统性综合实验的操作，提高学生的实验操作 技能，同时在掌握方法的基础上，增强综合运用、实验 设计及观察分析能力，提高学生的科研兴趣及解决实际 问题的综合素质与能力。本课程主要目的和目标 主要内容一、园艺植物光合作用分析技术二、园艺植物与土壤中痕量元素的测定原子吸收分析法三、园艺植物与土壤中氮磷的测定连续流动分析法差异四、园艺植物芳香物质分析气相色谱、质谱分析技术五、糖类（激素）分析技术液相色谱分析法六、蛋白质分离纯化柱层析分析技术七、蛋白质分离鉴定双向电泳分析技术八、园艺植物组织切片与显微观察技术第一章 植物光合与荧光生理指标的测定（一）园艺植物光合指标的测定（二）园艺植物荧光指标的测定本章的主要内容1、植物光合作用原理及常规测定方法2、LI-6400光合作用系统构成原理及测定内容3、LI-6400光合作用系统在测定过程中常见问题及 解决方法实验一 使用LI-6400光合作用系统测定园艺作物光 合生理指标 实验二 使用LI-6400光合作用系统进行园艺作物光 合CO2响应曲线的测定1、植物光合荧光作用原理及常规测定方法 2、LI-6400荧光系统测定作物荧光指标的方法 3、影响作物荧光的因素及测定中的注意事项实验三 使用LI-6400荧光系统测定作物光化学效率 实验四 使用LI-6400荧光系统测定作物电子传递速率 与光化学猝灭绿色植物吸收阳光的能量，同化CO2 和 H2O，制造有机物并释放氧的过程，称为光合作 用。光合作用所产生的有机物质主要是糖类， 贮藏着能量。CO2 + H2O （CH2O） + O2可见，测定公式中任一反应物的消耗速率 或产物的生成速率（包括物质的交换和能量的 贮藏）都可以用来计算净光合速率（Pn）。一、光合作用测量的理论基础 净光合速率（Pn）的测定方法（1）根据有机物的积累速率，主要有半叶法、植 物生长分析法； （2）根据CO2 及O2 体积的变化，主要有微量定积 检压法； （3）根据O2 浓度的变化，主要有氧电极法； （4）根据CO2浓度的变化：酸度法、碱吸收法、 14C 标记法、红外气体分析法、微气象法。目前，最常见的方法是红外气体分析法。二、LI-6400光合作用测量系统 LI-6400是美国LI-COR公司的第三代气体交换测量系统 主要特点： （1）开路式系统，保证了叶室内外环境条件的一致与同步 变化，同时保证了被测量叶片的环境因子的稳定；（2）CO2/H2O 分析器位于传感器的头部，消除了气体交换测 量的时滞；（3）可自动或手动控制叶室内部的环境条件（CO2浓度、光 照强度、相对湿度、温度等），方便地进行环境条件控制 下光合速率的测定以及响应曲线的测定。（4）具有多个自动测量程序，如光响应曲线、CO2 响应曲 线、光诱导曲线、光呼吸曲线、荧光CO2 响应曲线、荧光 光响应曲线、荧光动力学曲线、荧光循环曲线等。（5）叶室小，结构简单，操作方便。（一）硬件部分控制器电缆线IRGA（红外分析器）或叶室主机外置光量子传感器（二）实验室配置叶 室 配 置荧光叶室土壤叶室标准叶室附 件LED红蓝光源CO2注入系统1、LED红蓝光源1）.可以提供02000mol m-2 s-1之间的任意光照 强度2）.产热极少，基本不对测量叶片的环境条件产生影 响。3）.LED红/蓝光源不仅提供红色光（影 响光合作用的最主要光照），也提供蓝 色光（控制气孔开放的最主要光）。红 色光的波长为665nm，蓝色光的波长为 470nm。蓝色光是研究气孔动力学的关键。 2、CO2注入系统1). CO2浓度是通过把精确控制的纯CO2注入 到已过滤了CO2的空气中来得到的。 2).可以确保高浓度CO2条件下的测量, 生 成完整的标准A-Ci曲线.3).在系统软件控制下,设定所需CO2浓度, 或者使用AutoPrograms(自动程序模式) 自动测量一系列不同浓度的数据.4).可以提供8小时高达2000 mol mol-1 的CO2气体 （三）工作原理LI-6400是气体交换测定系统。 光合作用与蒸腾作用的测量是 基于流经叶室的气流中CO2和H2O差异。 开放式气路系统是以气泵为动力，空气流经 同化室后排出，由于叶片光合气体中的CO2被部 分吸收，用IRGA测量进入同化室和流出同化室 的空气中CO2浓度差，并按下式计算出光合速率 ：Pn=FC/S式中：Pn-光合速率；F-气体流量；C-同 化室进气口与出气口CO2浓度差；S-叶片面积 。（四）LI-6400便携式光合作用仪功 能测 量 参 数 和 计 算 参 数 可计算光合作用指标l表观量子效率（AQY）：指200 mol.m-2.s-1低光强下光 光合作用最初直线方程的斜率。l羧化效率（CE）：又称叶肉导度，是在CO2浓度低于 250 mol.m-2.s-1以下时测算出CO2 光合直线方程的斜率 。 l气孔限制值（Ls）： Ls1Ci/Ca l光呼吸速率： 2O2、340mol.mol-1 CO2低氧气体下 的呼吸速率。 lCO2利用率（CUE）： CUE（PnetTl RdarkTd ）/ （PgrossTl） Tl和Td分别为光期和暗期（以小时计） Pgross和Pnet分别为粗、净Pn Rdark代表暗呼吸速率 可进行的自动测量l 光响应曲线：根据拟合曲线得出光饱和 点、光补偿点、表观量子效率等参数。 l CO2 响应曲线：主要研究CO2饱和点 、CO2补偿点和羧化效率 l荧光CO2 响应曲线 l 荧光光响应曲线 l 荧光动力学曲线 l 荧光循环曲线等。三、测量中的注意事项植物的光合作用和其它的生命现象 一样，也经常受着外因和内因的影响而不 断地发生变化。影响光合速率的外部因素 有：光照、C02、温度、矿质元素、水分 、氧、日变化等内部因素有种间差异、品 种间差异、叶片性状、果实的存在等。因 此时间的选择对测量的准确性至关重要。 测定时间的选择选择晴天无云的上午9：3011： 30测定较理想。除非设计测量阴天或夜间 的光合情况，以及日变化测量。 注意：不同生育期一般测1-2次， 天气情况要统一2.选样叶位要统一 代表性：选择最能代表叶色的植株 叶子的状态应选无病，完整，生 长健壮，向阳的功能叶片。包括处理的代表性，温室或露地 不同栽培位置等的代表性。3.触样尽量不要触摸所测量的叶片，更不要触摸 所测部位的叶表面。4.测定时夹样品上样时要叶面朝上轻铺到叶室中，叶片 不能有折叠或褶皱。 另一方面，叶片要夹 在叶室的有效部分，即32cm的标准叶室 内，防止叶室漏气而测量不准。5.数据记录当样品室CO2的浓度稳定时记录数据；也可观察CO2的 值，稳定时记录数据。（通常一棵健康植株叶片的Gs值 应在0.11.0之间。超出此范围，即不正确。）6.叶室位置叶室要固定，与太阳光的位置要依据是否用自带光源 而定。当用自然光时，叶室要垂直太阳光放置；若用仪 器自带光源，叶室最好平放。因为这样，外界光量子传 感器的位置与植物叶子在植株上长的一样，垂直向上， 外界光量子参数也有用。 7.空气缓冲气瓶“Li-6400光合作用测定仪”是通过测量参 比室和样品室的气体浓度差异来测量光合速率 和蒸腾速率的。外界空气中CO2浓度的自然波 动(尤其是人为干扰比较大的情况下)必然造成参 比室和样品室浓度的差异，需采用气体缓冲瓶 来尽可能降低这一波动所造成的误差。一般空 气缓冲气瓶应放在远离人群、远离交通的通风 之处。如在室内或温室做实验需更大的缓冲， 但不能采取把进气管放在室外而机器在室内进 行实验。8.LED光源LED光源即红蓝光源，是“Li一6400光合作 用测定仪”的配件之一。天气晴朗时可不用LED 光源，直接利用自然光测定自然状态下的光合 速率。LED光源虽能模拟一天的日变化，并迅 速测完，但与自然条件下植物光合速率的日变 化相差很远。如果测光补偿点或在阴天或多云 的日子测定时，LED光源是不可缺少的。9.环境控制环境条件控制包括流量控制、 CO2浓度控 制、温度控制、光照控制等指标。一般情况下 ，流量控制意义不大，在外界自然条件下测量 流量为500mols，温室中测定流量为 300mols，并最好控制温度和光强等因子。 光曲线的测定需要进行光照控制，CO2浓度控 制对于 ACI曲线的研究非常重要。一般不做温 度控制，除非进行温度曲线的测量。使用中仪器常见问题1、如果参考室浓度（CO2 R _ml值）显得稳定, 而样本室浓度（CO2S_ml值）不稳定,这将提 示传感器头某处漏气。如果两室都不稳定,则是 主机漏气，应检查可能发生漏气的地方。2、进行光合作用时，样本室的CO2浓度（ CO2S_ml值）不变化，可能的原因：检查传感器头部的风扇是否在旋转？如是， 请按照清洁光学通道的步骤清洁风扇。3、传导（Ci）低或为负值排除植物本身或所选测量叶片的生长状态不 佳和外界环境（如，低温，或弱光）的因素外 ，一可能是在水分调零时间短，以湿空气调零 。解决的办法是，水分调零应调的时间长些， 百分位上的数波动时，才算稳定。二可能是干燥剂使用时间太长，需更换药品 。4、如果光合作用值太高,Ci将太低。其主要的起因 :IRGA匹配不良。5、“IRGAs Not Ready“信息，电源（1）IRGA接头未插紧,电缆不好,IRGA电路板 保险丝烧断。（2）IRGA不起作用如果电源接到IRGA,但它仍不起作用,可能是导 光轮电机停转。（3）光照暗样本室积垢太多,光学元件积尘,或者红外光源或 探测器失效。半叶法 植物进行光合作用形成有机物，而有机物的 积累可使叶片单位面积的干物重增加，但是， 叶片在光下积累光合产物的同时，还会通过输 导组织将同化物运出，从而使测得的干重积累 值偏低。为了消除这一偏差，必须将待测叶片 的一半遮黑，测量相同时间内叶片被遮黑的一 侧单位面积干重的减少值，作为同化物输出量 （和呼吸消耗量）的估测值。这就是经典的“半 叶法”测定光合速率的基本原理。测定时须选择 对称性良好、厚薄均匀一致的两组叶片，一组 叶片用于测量干重的初始值，另一组（半叶遮 黑的）叶片用于测定干重的终了值，不但手续 烦琐，而且误差较大。 氧电极法 氧电极法是一种实验室常用的测氧技术。 氧电极由嵌在绝缘棒上的铂和银所构成， 以氯化钾为电解质，外覆聚乙烯薄膜，两 极间加0.60.8v的极化电压，溶氧可透过 薄膜在阴极上还原，同时在极间产生扩散 电流。此电流与溶解氧浓度成正比，电极 输出的记号，可在自动记录仪上记录下来 。叶片在进行光合作用时如光合速率高， 则放氧量多，溶解氧也多，叶片光合作用 的放氧量，可以作为测定光合速率的指标 。 红外气体分析法 由于 CO2对红外线有较强的吸收能力， CO2含量的微小变化即可灵敏地反映在检 测仪上。 红外气体分析法是根据光合过程中吸收 CO2的多少，直接计算出光合速率大小的 一种测量方法，具有省时、省力、测量参 数多等优点，更重要的是此法重复性好、 数据稳定、准确，是目前最常用的一种方 法。