第八章 喜树碱的药物设计，靶向癌 细胞死亡与基因王伟宁1.引言 喜树碱是四十多年前发现一种植物抗癌药物。 拓扑异构酶是一种非常重要的DNA操作酶 ，是唯一知道的喜树碱的靶点，它结合在共价 蛋白核酸复合物的界面。这主要与喜树碱的化 学与生物学的三个方面有关：一是以拓扑异构 酶为靶点合成的喜树碱抗肿瘤衍生物，二是 由拓扑异构酶抑制剂诱导的细胞死亡机制， 三是拓扑异构酶抑制剂靶点所对应的特定的 DNA序列。作为设计抗癌药物的首选天然产 物，或是作为研究拓扑异构酶对DNA新陈 代谢的实验工具。 20-(S)-Camptothecin (CPT)最早是在1966年，由 美国的Wall等从中国特有的珙桐科植物喜树中提 取到的，由美国国立肿瘤研究所（NCI）动物模型 上证实其抗肿瘤作用，并将其水溶性钠盐用于临床 试验。在过去的四十年，从大量的植物科中发现了 这种单萜吲哚类生物碱，包括茜草科、夹竹桃科、 钩吻科、茶茱萸科等。 尽管有抗肿瘤的活性，但是后来发现碱处理开环后 药物活性明显下降，同时还伴随着严重的毒性反应包括严重的腹泻、出血性膀胱炎，使得CPT类 化合物的临床研究就此中断。1985年发现CPT特 异作用于核内蛋白拓扑异构酶。二十年后，拓扑 异构酶仍是已知的CPT的唯一靶点，这使得这种 生物碱成为真正的靶点抗癌制剂。2.喜树碱：拓扑异构酶- DNA复合体的分子钳 DNA拓扑异构酶是生物体内及其重要的细胞 核内酶，参与DNA复制、转录、重组和修复等 所有关键的核内过程。拓扑异构酶为单体性 100kDa的多肽，由染色体20q1213.2位基因编 码，可松解过度卷曲的DNA双链，以利于复制 及转录的进行。酶先与DNA结合，成为可断裂 复合物，在DNA磷酸二酯键上形成一个单链缺 口，让未受损的单链从缺口中回转，使DNA松 弛，以利于复制或转录，随后将缺口连接。 CPT类化合物的作用机制是参与Topo作用过程 中与DNA形成的“可切割复合物”，阻碍DNA链 的闭合，导致细胞DNA单链断裂（SSB），这 种单链断裂对细胞来说并不是致死性的，当可切 割复合物与正在进行复制的DNA复制又相遇时 ，会继发性的造成不可逆的DNA双链断裂（ DSB），最终引起细胞死亡。 因此，S期细胞对CPT类化合物特别敏感。另外 ，CPT稳定的可切割复合物也作用于RNA聚合酶 的转录过程，抑制RNA的合成，在DNA模板链 形成不可逆的单链断裂，并在启动子区域引起少 量双链断裂。 3. CPT衍生物的设计：永无 止境 根据在A-B、C-D、E环上取代基位置的不同， 可以将CPT衍生物分成三类。 第一类：A-B环的修饰。早期发现，A-B环被 取代后不丧失活性。这个二元环上可以被许多 官能团取代，特别是在7位、9位和10位上， 尽管会保留甚至在某些情况下会提高天然产物 的细胞毒性。当前已经研发了两种主要的抗癌 药拓扑替康和伊立替康，并且已经用于临 床。 拓扑替康（TPT），又名拓泊替康、和美新， 结构如图。本品为CPT半合成衍生物，作用靶 点为Topo，为S期抗肿瘤药。临床前研究表 明，TPT抗肿瘤谱较广，对L1210和P338白血 病小鼠的活性及在体内抗Lewis肺癌和B-16黑 色素瘤的作用均优于CPT。在人结肠癌异体移 植物，TPT可以诱导肿瘤消退及延缓其生长。 1996年，美国FDA批准其为治疗卵巢癌的二 线药物。2000年，被批准为治疗小细胞肺癌 的二线药。 不良反应：1.骨髓抑制：中性粒细胞下降、血 小板减少、贫血等，为主要限制性毒性。2.胃 肠道反应：恶心、呕吐、腹泻、便秘、肠梗阻 、腹痛、口腔炎、厌食等。3.皮肤反应：脱发 ，偶见严重的皮炎及瘙痒。4.神经肌肉反应： 头痛、关节痛、肌肉痛、全身痛、感觉异常。 5.呼吸系统反应：可致呼吸困难。 6.肝脏：有 时出现肝功能异常，转氨酶升高。7.全身反应 ：乏力、不适、发热等。8.局部刺激：静脉注 射时，若漏出血管外可产生局部刺激、红肿。 伊立替康（CPT-11）：又名开普拓，结构如图 。1998年，被批准与5-FU（5-氟尿嘧啶）和叶 酸联用，作为治疗转移性结肠癌的一线药物，现在也是治疗非小细胞肺癌的一线药物。CPT- 11是一个水溶性前药，在体内被羧酸酯酶代谢成 活性形式SN-38，结构如图。SN-38是主要活 性代谢产物，其活性比CPT-11强1001000倍。 SN-38经肝脏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（ UDP-GT）生成葡萄糖醛酸化SN-38（SN-38G ）。当SN-38G分泌进入肠道，肠道中细菌的- 葡萄糖醛酸酶又能使之变回SN-38。存在药物 的肝肠循环。 不良反应：1.胃肠道：迟发性腹泻（给药24h 后发生的腹泻）、恶心与呕吐、厌食、腹痛及 黏膜炎。2.血液学：中性粒细胞减少。3.急性 胆碱能综合症：主要症状为：早发性腹泻及其 他症状，如用药后第一个24小时内发生：腹 痛、结膜炎、鼻炎、低血压、血管舒张、出汗 、寒战、全身不适、头晕、视力障碍、瞳孔缩 小、流泪、流涎增多，以上症状于阿托品治疗 后消失。4.其它作用：早期的反应如呼吸困难 、肌肉收缩、痉挛及感觉异常等均有报道。 除了拓扑替康和伊立替康，还有很多A环和B 环上被取代的CPT衍生物，如图： 第二类：C-D环的修饰。对于C环和D环 的衍生物，他们一般没有活性或比CPT 的活性低很多。在这一类中，唯一用于 临床开发的是C环修饰的衍生物DRF- 1042，在5位有一个取代基，现在已经 进行到临床期开发阶段。 第三类：E环的修饰。A-B环或C-D环的修饰往 往是增加CPT的水溶性，并且减少内酯环E环 开环形成无活性的羧化物形式。在以往的研究 中，对CPT内酯环E环的改造都会造成化合物 失活，因此一直以来认为，E环是CPT的活性 必须基团，在结构修饰中一般都避免对E环的 改造，而新一代的高喜树碱，用七元环替代了 六元内酯环，能消除E环的分子内氢键，降低 羰基活性。其中，二氟取代物Diflomotecan （BN280915）结构如图。 它是一种口服的拓朴异构酶抑制剂，在临床 期开发阶段，在体内的稳定性较topotecan 好，副作用特别是胃肠道毒性似更少。另外， 发现该类化合物中的BN280927兼有抑制 Topo和Topo两种酶的作用，但不形成 Topo可切割复合物。该化合物对G0期的肿 瘤细胞也有明显的抑制作用，细胞水平的 IC50低于SN38，并且对SN38的耐药株也有 很强的细胞毒作用。 4.DNA修复或细胞死亡 Topo介导的DNA损伤的修复机制是复杂的，同源重 组在DNA损伤中起着重要作用。Topo介导的DNA损 伤也涉及其它的DNA修复复合物，比如与TopoIII相 关的ReqQ解旋酶参与的碱基切除途径。喜树碱类药物 为细胞周期特异性药物，主要作用于S期，并对G2+M期 边界有延缓作用；它能够抑制DNA Topo将DNA断端 重新接上的正常功能，并进一步造成DNA链的断裂损伤 ，从而控制DNA复制，阻断RNA合成（即转录）、干扰 细胞分裂周期（延迟G2期），最终导致癌细胞的死亡。 当DNA损伤超过DNA修复的时候，细胞就会不可避免 的趋向死亡。迄今为止，最好的描述由CPT诱导的细胞 死亡机制称为细胞凋亡。 Caspases（半胱天冬酶，胱门蛋白酶）是一 类蛋白裂解酶，在细胞内以无活性的酶原形式 存在。半胱天冬酶具有半胱氨酸激活位点和底 物裂解位点，当作用于胞内特异性底物后将引 起细胞凋亡。但当它们被激活后并不会降解胞 内的所有蛋白，相反，它们只会选择性的作用 于自身的靶蛋白，在靶蛋白一级结构中Asp（ 天冬氨酸）残基的位置之后将靶蛋白裂解，介 导细胞发生凋亡。5.拓扑异构酶介导DNA 断裂的序列特异性靶点 Topo毒剂可以作为抗生素直接作用于细菌的Tope，也 可以作为抗肿瘤制剂直接作用于真核生物的酶类。但是 ，一些局限性阻碍了它们的广泛应用。毒性是重要的不 需要的次生效应。比如，TopoII毒剂，会因为化疗引 起白血病。这些副作用与Tope有非常弱的序列特异性 有关在裂解位点周围只有一个或两个碱基。比如， 对于CPT来说，只在T和G之间断裂。因此，化学家们 正致力于增加这些药物的特异性。一种策略是，通过使 用前体药使药物只在肿瘤细胞处释放。另一种策略是， 将药物共价结合到DNA配体上，然后再将这个特异性 序列结合到DNA上，从而增加DNA的特异性。 第二种策略的图解6.喜树碱类化合物的构效关系 A、B、C环：1）在C-7、9、10位及11位引入 不同的取代基，特别是7位和10位引入双取代 基，可干扰喜树碱开环形式及喜树碱与人血清 白蛋白的结合，从而提高内酯在体内的稳定性 。2）在C-7、9；C-9、10；C-10、11间增加 一个环，虽然不能增加内酯环的稳定性，但能 增加体内和体外的肿瘤活性。 3）在C-5、12、14位取代则活性降低或丧失。 4）B环饱和，几乎无活性。 D、E环：1）20位的氧为活性必需，内酯环氧 被氮或硫取代，活性丧失。2）D环吡啶酮为抗 肿瘤活性必需。3）20（S）异构体较20（R） 异构体活性强10100倍。4）E环扩环成七元 内酯环，形成高喜树碱能消除E环的分子内氢 键，降低羰基活性。 5）E环羟基可以酯化，以增大羰基的 位阻并破坏分子内氢键。其引入脂肪族 氨基酸、大分子或糖均能增加药物的稳 定性和水溶性。6）去除E环的AD四 元环衍生物活性降低或丧失，说明喜树 碱的内酯环是其抗肿瘤的关键部位。第九章 靶向胸苷酸合成酶的抗叶 酸药物的癌症治疗1.引言 四氢叶酸衍生物是细胞一碳代谢中的重要辅 酶。在某些氨基酸、嘌呤和嘧啶的生物合成 反应中，四氢叶酸衍生物作为各种酶的特殊 底物，提供羟甲基、甲酰基和甲基等一碳单 位，发挥着重要作用。抗叶酸药物是以叶酸 依赖性酶为靶点，设计合成的与这些酶的特 殊底物（即叶酸辅酶）结构相似的一类化合 物，它们和酶结合后可阻止正常底物与酶的 结合，从而干扰细胞的叶酸代谢和一碳代谢 一些抗叶酸药物通过阻断DNA生物合成中 所需的嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合成，导 致肿瘤细胞的死亡，在临床上用作抗肿瘤 药物。 最早用作抗肿瘤药物靶点的叶酸依赖性酶 是二氢叶酸还原酶（DHFR）。DHFR催化 二氢叶酸还原成四氢叶酸，然后在其他酶 的作用下生成四氢叶酸的各种活性衍生物 。因此，它在叶酸代谢循环中处于中心地 位。 例如，抗叶酸药物甲氨蝶呤（MTX）， 它作为一种叶酸还原酶抑制剂，主要抑制 二氢叶酸还原酶而使二氢叶酸不能还原成 有生理活性的四氢叶酸，从而使嘌呤核苷 酸和嘧啶核苷酸的生物合成过程中一碳基 团的转移作用受阻，导致DNA的生物合 成受到抑制。主要用于儿童急性白血病和 绒毛膜上皮癌，可作为免疫抑制剂应用。 胸苷酸合成酶作为抗癌药 物的靶点 胸苷酸合成酶（TS）系有相同亚基构成的同源 二聚体胞浆酶，它参与体内DNA生物合成所需 的胸腺嘧啶核苷酸的起始合成过程，是该过程 的限速酶。TS催化脱氧尿苷一磷酸（dUMP） 的甲基化反应，生成脱氧胸苷一磷酸（dTMP） ，在此过程中，5,10-亚甲基四氢叶酸提供甲基 。此后dTMP发生磷酸化形成脱氧胸苷三磷酸（ dTTP），后者是DNA生物合成的必需物质。这 是细胞内从头合成dTTP的唯一途径，因此TS是 肿瘤化疗的一个关键靶点，抑制TS将导致细胞“ 无嘧啶死亡”。 根据TS的结合特性，其抑制剂可分为嘧 啶类似物（与TS底物位点结合）、叶酸 类似物（与TS辅酶位点结合）及具有独 特结构的TS抑制剂（它们不与底物结合 位点和辅酶结合位点结合，但具有TS抑 制活性）3类。 嘧啶类似物TS抑制剂：5-氟尿嘧啶（5-FU ）：该药首先在体内转变成氟尿嘧啶脱氧核苷 酸与TS结合，再与辅酶5,10-亚甲基四氢叶酸 作用，由于氟尿嘧啶脱氧核苷酸C-F键很稳定 ，导致不能有效地合成胸腺嘧啶脱氧核苷酸， 使TS