杂交瘤技术制备单克隆抗体抗体部员工培训之单克隆抗体（McAb）：是由只识别单一抗原决定簇的B细胞克隆产生的同源抗体。理化性状高度均一效价高只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一具有高度特异性又易于大量制备如何获得McAb?如何大量获得McAb?需要克服哪些技术问题？理想的抗体分泌细胞：具有合成和分泌抗体的能力具有大量无限生长的特性在1975年，Kohler 和Milstein将来源于小鼠骨髓的骨髓瘤细胞和啮齿动物可以分泌抗体的细胞融合后形成杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限繁殖的能力，也具有免疫细胞分泌抗体的能力，后来将这种杂交细胞系统统称为杂交瘤（hybridoma）。通过筛选，分离得到针对特异性抗原并具有所要求的抗体亲和力的杂交瘤细胞。在适当营养条件下，杂交瘤细胞能够生长和无限制性传代，并且能产生大量单一类型的抗体及单克隆抗体。一、杂交瘤技术的基本原理二、单克隆抗体的制备三、单克隆抗体的应用一 杂交瘤技术的基本原理利用聚乙二醇作为细为细 胞融合剂剂，使免疫的小鼠脾细细 胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细细胞融为为一 体，在HAT选选择择性培养基的作用下，只让让融合成功的杂杂交瘤细细胞生长长，经过经过反复的免疫学检测筛选检测筛选 和单单个细细胞培养（克隆化）,最终获终获 得既能产产生所需单单克隆抗体,又能不断繁殖的杂杂交瘤 细细胞系，将这这种细细胞扩扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产产生的腹水中即可得到高效价的单单克隆抗体。 流 程杂交瘤技术1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，可溶性抗原10-50ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔， 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次）冲击免疫（融合前3天进行）选用6-12周龄Balb/c小鼠 免疫方案不产生Ig的重链和轻链HGPRT-与提供淋巴细胞的动物品系相同小鼠骨髓瘤细胞处于免疫状态脾脏中的B淋巴母细胞或浆母细胞动 物：612周龄20g25g体重免疫脾细胞细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：不同的分子质量、浓度、作用时间、pH,可能直接影响融合效果细胞融合培养骨髓瘤细胞：对数生长期浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞1-2107免疫脾细胞的制备：1-2108 无菌手术饲养细胞：常用小鼠腹腔巨噬细胞，5-8106分泌细胞生长因子吞噬衰老细胞和微生物存活一般不超2周，不影响杂交瘤细胞的纯化杂交瘤细胞的选择性培养细胞DNA合成途经：1.替代途径：次黄嘌呤（H）HGPRT 2.主要途径： 氨基酸 鸟嘌呤核苷酸 谷氨酰胺 （A-） 尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNAHAT选择培养基的原理HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，57天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，57天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次阳性杂交瘤细胞的克隆化有限稀释法(limiting dilution) 软琼脂平板法(soft agar method)单细胞显微操作法(micromanipulation)荧光激活细胞分类法法（fluorescence activated cell sorter， FACS ）克隆化方案：特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.51个细胞有限稀释法在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系时，细胞培养过程中随时可能发生细胞污染，分泌抗体能力丧失等“慢冻”：分步冷冻，30-70液氮 “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义杂交瘤细胞检定杂交瘤细胞检定1.抗体分泌稳定性 抗体连续传代法-保持稳定分泌特异性抗体 2.细胞核学特征 检查细胞分裂中期染色体-保证不丢失产生抗体基因的染色体 3.鼠源病毒检查 细胞试验，动物抗体产生试验，鸡胚感染试验等-排除单抗制品的 病毒污染 4.支原体检查 荧光染色法，培养法，分子生物学法等防止污染 5.无菌试验 直接接种法，薄膜过滤法二 单克隆抗体的制备经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。 动物体内诱生方法：操作简便，经济主要用于生产科研或诊断用单抗腹水浓度可达2-5mg/ml实体瘤法、腹水制备法体外培养法：使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞工艺简单、易控制，可大规模生产浓度不高，200-500ug/ml悬浮培养法、固相培养法单克隆抗体的产生腹水制备法预先腹腔注射降直烷或液状石蜡1-2周后注射（15）106细胞13w形成腹水5-20mg/ml,1-10ml高滴度腹水抗体特异性鉴定：抗原类似物的交叉反应Ig类型、亚类鉴定：双扩法或ELISA法McAb中和活性鉴定：动物或细胞的保护实验McAb识别抗原表位测定：用竞 争结合法，测相加指数法McAb亲和力测定：ELISA 单克隆抗体性质鉴定注意事项注意事项1.污染细菌，真菌，支原体2.杂交瘤细胞不分泌或停止分泌抗体HAT中A失效；免疫原的抗原性弱，免疫效果差；支原体污染；抗体非分泌细胞竞争性生长；染色体丢失预防措施预防措施1.大量保持和补充液氮冻存的细胞原管；2.倒置显微镜经常检查细胞生长状况；3.不让细胞“过度生长”4.不让培养物不加检查任其连续培养几周或几月；抗体的纯化： 硫酸铵沉淀 凝胶过滤法 离子交换层析 亲和层析硫酸铵沉淀大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出血清50%饱和度硫酸胺上清 （清蛋白） 沉淀（球蛋白）33%饱和度硫酸胺上清 沉淀拟球蛋白 r球蛋白凝胶过滤法凝胶过滤法干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。交联葡聚糖凝胶(Sephadex)琼脂糖凝胶(Sepharose)离子交换层析法离子交换层析法DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂亲和层析法将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）。A蛋白-Sepharose CL 4B三、单克隆抗体的应用检验医学诊断试剂（1）病原微生物抗原抗体的检测（2）肿瘤抗原的检测（3）免疫细胞及其亚群的检测（4）激素测定（5）细胞因子的测定蛋白质的提纯肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术