生物化学实验设计过程 生物化学分析方法 主要生物物质分析（含量和活性测定） 实验材料的选择与处理 目的物的提取与分离 生物物质的浓缩、干燥、保存及纯度鉴定第二章：生物化学分析的常规方 法生物化学实验的化学过程生物化学实验的物理过程实验方法的组合一、生物化学实验设计过程1、实验的化学过程几个要求分离试剂与目的物不发生化学反应或相互作用 ，不改变其属性，保存分子的原独立 状态。易使目的物发生存在状态的变化（溶 解度、分配系数等）。不易残留，易回收处理，对人体和 环境不易造成损害。鉴定试剂与目的物发生化学反应敏感，用量越少 越好。与目的物结合专一性越强越好。几个要求配制提 取液所 需试剂明确目的物溶解性，确定溶剂。根据目的物用途确定溶剂类型（如用于 食品以不含有毒有害成分为准则，用于 分析则要专一性好、灵敏度高）。根据所具有的条件及鉴定提取的需要进 行确定。提取溶 剂的 pH 值利用目的物解离、沉淀物形成及稳定。目的物解离或沉淀中仅有物理性状变化。目的物可溶性好，鉴定时专一性好。对试剂选择总的要求： 1.满足对目的物最大限度的溶解和分离要求，对于鉴定试剂要越纯越好，灵敏度 和转移越高越好。2.用于起相同或相近作用的试剂要选择成本低、用量少的试剂 。3.所选择的试剂只能促进目的物向实验目的方向转移，而尽量不产生副反应。2、实验的物理过程（1）物 理过程的 特点目的物状态的 转变只受物理 因素（温度、 压力、黏度、 溶剂介电常数 等）的制约制备性实验物质状态变化影响目的物状 态的因素：目的物分离量分离过程无目的物性质改变鉴定性实验目的物感官的突出性目的物固有本质的显著性目的物属性的明朗化目的物应用性的增强（2）物 理过程所 需设备的 选择制备性实验分析鉴定类实验定性定量兼有类实验选择原则：尽量 选择工作效率高 、精确度大、分 辨率好的设施和 器具。综合性实验验证性实验关键：大量收集资料进 行方法上的分析、比较 ，全面了解各方法的优 缺点及使用条件等，形 成自己的实验方案，然 后再行选择。依据实验 性质选择依据方 法的设 计选择对实验器 具和方法 选择的忌 讳脱离客观条件 不根据所设计实验方案选择器具和设施所选仪器方法贪大求全实验方案设计与专业学科脱轨3、实验方法的组合实验方法的组合的目的：构成一个实验流程的工作路线 ，避免盲目。要明确：做什么？用什么材料做？涉及的 器具和设施有哪些？工作量有多大？关键工作是什么？ 难点是什么等？制备性实验的流程：材料选择破碎匀浆固液 分离初步纯化精制浓 缩干燥产物实质：目的物的转移过程。主线：保持目的物 被独立转移的状态（保持良好的活性）。条件 控制和设施操作处于中心位置，要求各步骤衔 接紧密，间歇短，一气呵成。分析鉴定性实验的流程：目的物抽样溶解溶液样品 显色成分测定换算分析 数据关键：显色反应。要求显色反应灵敏、 精确、稳定，重复性好。该类实验的多 环节设计组合越简化越好，时间越快越 精确。生物化学实验过程的设计1、对分离制备性实验，尽量做到目的 物回收率、纯度、活性均较高；2、整个过程参与环节的组合越紧凑越好，活 性和目的物流失越少越好；3、设备和试剂的选择要根据目的物的要求确定用 量以减少消耗；4、整个流程要有可操作性，同一操作方法，尽量避免重复使 用。二、 生物化学分析方法重量法化学法分光光度法（比色分析法）酶法色谱法生物化学分析的目的：测定一定供试样本中某类或某种生化物质的含量或活性。1.重量法重量法：通过一定的方法和程序，从供试样本中提取、纯化出某一类或某一种成分，求出其在样本中 所占比例的分析法。常用重量法分析的生物物质：水分、灰分、粗脂肪、纤维素等。例：油料作物种子粗脂肪的含量的测定选取具代表性的种子，去杂质，按四分法缩减取样 。然后按国家标准（GB）制样、取样、抽提、干燥、称重、计算含量。2.化学法化学法：根据物质间的化学反应，按照等物质量规则建立的分析方法。如酸碱滴定法、氧化还原滴定法、络合滴定法等 。常用化学法分析的生物质：蛋白质（粗蛋白）含量、维生素C含量和某些酶活性测定等。例：植物样品中总蛋白（粗蛋白）含量的测定原理: 加热植物样品+H2SO4 催化剂 (NH4)2SO4+H3PO4+CO2 +SO2 +SO3 (NH4)2SO4+2NaOH 2H2O+Na2SO4+2NH3 NH3 +4H3BO3 NH4HB4O7+5H2ONH4HB4O7+HCL+5H2O NH4CL+4H3BO33. 分光光度法 分光光度法：是利用物质所特有的吸收光谱来测 定其含量的一项技术，其基本依据是朗伯-比尔定律。 分光光度法是生化分析中最常采用的技术（灵敏 度高、操作简便、精确、快速，对于复杂的组分系 统，不需分离即可检测出其中所含的微量组分）， 涉及各种生物物质的分析及酶活性的测定。紫外 可见吸收光谱法是根据溶液中物 质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射 能的吸收来研究物质的组成和结构的方法 。 4. 酶法酶法分析的优点：选择性强，不受体系中共存 物质的干扰；灵敏度高，可测10-10g的微量物质。酶 法化学法仪器法直接测定法（产物的生成或反应物的减少）间接测定法（利用偶联反应体系进行）5. 色谱法色谱法的主要作用：是实现混合物中各组分的有效分离，完成定性、定量分析。纸色谱、薄层色谱、薄膜色谱等通常用于定性分 析；而高效液相、气相等色谱则可做到短时间准 确完成生化物质的分离和定量分析。三、 主要生物物质分析水分测定碳水化合物分析脂类物质分析蛋白质分析核酸分析矿物质分析维生素分析1. 水分测定（生化分析的基础） 常用水分测定方法：加热干燥法加热干燥法真空干燥加热法常压加热干燥法各种研究中不同 物质分析结果的 比较，利用实验 材料的长期保存 。适用于受高 温易变化的 材料。 条件：真空 干燥箱（5- 100mmHg、 40-100）适用于相对耐高温材料。 条件：普通干燥箱。干燥一般过程 ：新鲜材料杀青（105 20min） ，然后80 烘至恒重（每次2h）。快速水分 测定仪 含水量的表示方法含水量（占鲜重%）=（鲜重-干重）/鲜重100鲜重法最常用的 方法水分测定注意事项： 测定样品少量，但需具有代表性必须考虑所测材料的热稳定性，如油料种子只能在40-70 下烘干。每次烘干后需加盖放入干燥器中冷却（一般需30min）后才能称重。烘箱内一次放入的样品不能过多，箱体边角和下层不能放置样品。干燥器下层放置未失效的干燥剂，干燥剂应占底部容积的1/3-1/2。2. 碳水化合物分析 碳水化合物（糖类物质）碳水化合物单糖 双糖 多糖有效碳水化合物： 单糖、低聚糖、糊 精、淀粉、糖原等 。 无效碳水化合物： 果胶、半纤维素、 纤维素、木质素等 。总碳水化合物=100-（水分+粗蛋白+粗脂肪+粗灰分）%可溶性糖:还原性 单糖、双糖和非 还原性双糖、寡 糖。 不溶性糖：淀粉 、果胶、半纤维 素、纤维素、多 缩戊糖等。 碳水化合物的定性定量分析方法最常用的方法，并以还原糖 测定方法为主。非还原糖和 多糖等的测定是将其水解转 化成还原糖进行测定，并以 还原糖来表示其含量的。测定方法物理法化学法碳水化合物测定可溶性糖测定还原糖糖测定可溶性总糖测定 淀粉的测定纤维素测定定性定量的依据：糖分子中的四种结构特征。 含有的自由醛基和酮基的还原性；分子中醇 醛缩水成糠醛或甲基糠醛与萘的成色反应；： 邻位的醛、醇成脎后做熔点分析和结晶体分析； 糖醇羟基的甲基酯化后进行气相色谱分析（组 分分析）。 可溶性糖定量测定的常用方法（1）可溶性糖的提取水提醇提适用于水果、 蔬菜等样品。 样品为糊状或 粉状。提取条 件:70-80水 浴加热1h.适用于含淀粉和葡聚糖较 多的样品。样品用80%乙 醇回流提取3次，每次 30min，提取液合并，蒸 去乙醇，蒸馏水定容。（2）还原糖的测定 3.5-二硝基水杨酸比色法（DNS比色法）该法属半微量定糖法，所测结果反应的是样品中各种还原糖的总量。优点：操作简便、快速、杂质干扰少，尤其适合批量测定 。测定浓度范围：大于50ng/ml,小于3.0mg/ml（样品 光吸收值不能超过0.8）;比色波长540nm；标准曲线（需过原点）所得结果一元回归后其方程中的相关系数 0.96，每次（每批）测定均制作标准曲线。注意事项 ：Somogyi-Nelson比色法（砷钼酸比色法）优点：重复性较好、产物 稳定，测定范围：10- 180g/ml；测测定波长长 560nm兰-埃农法（lan -Eynon） 姆松-华尔格法（Munson -Walker）国际食糖分析方 法统一委员会于 1964年确定的还 原糖标准分析方 法。 优点：准确性高 、重现性好。常量法；为 斐林式滴定 法的改进方 法（3）可溶性总糖的经典测定方法 原理：可溶性糖（单糖、寡糖、多糖）与强酸共热生成糠醛衍生物，后者 与显色剂缩合成有色络合物，便可进行比色测定。方法苯酚-硫酸法蒽酮-硫酸法地衣酚-硫酸法优点：简单、迅速、灵敏，颜色持久 缺点：所用试剂腐蚀性强，有色样品结 果偏高，不理想。优点：简单、迅速、灵敏。 缺点：蒽酮试剂需当日配用；色氨 酸含量高的蛋白质对显色反应有干 扰；实验操作要求较高。该法操作简单，主要用于糖蛋白中总糖 的测定。缺点：氨基糖的存在可导致颜 色降低、色氨酸也可导致误差 。组分分析：薄层层析法、高效液相色谱法。淀粉的测定方法酸碱洗涤法（传统方法）Van Soest酸洗涤剂法（ADF）粗纤维的测定方法CaCl2-HAcO浸提-旋光法淀粉糖化酶-酸水解法目前广 泛采用 的方法 （粗纤 维测定 仪） 脂类单纯脂类单纯脂类复合脂类复合脂类非皂化脂类非皂化脂类酰基甘油酯酰基甘油酯蜡蜡 磷脂磷脂糖脂、硫脂糖脂、硫脂 萜萜 类类甾醇类甾醇类含有脂肪酸含有脂肪酸不含脂肪酸不含脂肪酸3. 脂类物质分析 脂质的提取有机溶剂萃取法机械压榨法溶解度法皂化法最常用的方法，一般采用非 极性溶剂（乙醚、氯仿、苯 等）提取非极性疏水结合的 脂质。根据溶解度差异进行的 分离提取。如卵磷脂易 溶于乙醇而不溶于丙酮 ，脑磷脂易溶于乙醚而 不溶于乙醇和丙酮主要用于可进行 皂化的甘油三脂 和高级脂肪酸的 提取主要用于从油料 种子，采用105- 106Pa的压力， 将流动性较大的 油挤压出来（毛 油） 组分分离、分析方法薄层层析色谱法（TLC） 分析方法气相色谱法（GLC）分离方法：层析法高效液相色谱法（HPLC）分离混合脂最有 效的方法。常用 吸附层析、离子 交换层析等。简单、快速、灵敏 的方法，是分离复 杂脂质的好方法。常用于甘油三脂组分、 磷脂组分、生育酚组分 、脂肪酸组分、甾醇组 分等的分析。脂质分析研究中广 泛应用的技术。主 要用于脂肪酸、甘 油三脂、生育酚、 甾醇等的分析与质谱连用鉴定 组成成分 粗脂肪的测定索氏提取法（粗脂肪提取）重量法（粗脂肪定量）4. 蛋白质分析 总蛋白（粗蛋白）分析：凯氏定氮法（微量、半微量、常量法）总蛋白（粗蛋白分析） 可溶性蛋白分析过程：消化、蒸馏、滴定、含量计算（蛋白质系数：6.26）蛋白质组成分析（氨基酸自动分析仪）加热植物样品+H2SO4 催化剂 (NH4)2SO4+H3PO4+CO2 +SO2 +SO3 (NH4)2SO4+2NaOH 2H2O+Na2SO4+2NH3 NH3 +4H3BO3 NH4HB4O7+5H2ONH4HB4O7+HCL+5H2O NH4CL+4H3BO3消化蒸馏滴定消化炉及消化过程半自动定氮仪： 蒸馏过程手控自 动进行全自动定氮 仪：蒸馏 、滴定、 计算同时 自动完成 。 可溶性蛋白质含量的测定方法含量测定方法双缩脲法考马斯亮蓝（Bradford）法Folin-酚（Lowry）法二喹啉甲酸（