实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥Arabidopsis thalianaNicotiana tabacum选择标记基因与报告基因必备条件：u编码一种不存在于正常植物细胞中的酶u基因较小u能在转化体中得到充分表达u检测容易，并且能定量分析选择标记基因与筛选标记基因：npt-II 新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（链霉素，壮观霉素），spe（壮观霉素），strl（链霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦）报告基因：report gene（筛选标记之一）在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。gus基因（-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因）转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。植物基因转化受体u高效稳定的再生能力u较高的遗传稳定性u具有稳定的外植体来源u对选择性抗生素敏感u对农杆菌侵染有敏感性植物基因转化受体系统类型：u愈伤组织再生系统u直接分化再生系统u原生质体再生系统u胚状体再生系统u生殖细胞受体系统植物遗传转化方法植物遗传转遗传转 化农农杆菌介导导法基因枪枪法PEG诱导诱导 原生 质质体电电穿孔法操作简单简单 ，易 造成原生质质体 损伤损伤双子叶植物无宿主限制 ，技术术限制原生质质体培 养转基因方法农杆菌侵染法基因枪法农杆菌侵染法农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系u 对单子叶植物不敏感 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。T-DNA整合植物基因组的分子机理T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。插入位点特点：uT-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点uT-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对u植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。真空浸透法转化拟南芥受体材料 拟拟南芥种子消毒与萌发发，播种后生长长出现现花蕾后打顶顶，待侧侧枝长长出花蕾后，侵染前 一天去除已开花蕾和果荚荚接种 接种含有表达载载体的农农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基(Rif 100 g/mL， Kan 50 g/mL)中，28 C，200 rpm振荡荡培养过过夜活化 将过过夜培养的菌液按照1:100的比例转转接到50 mL新鲜鲜配制的YEP液体培养基(Rif 100 g/mL，Kan 50 g/mL)中，28 C，200rpm振荡过荡过 夜培养至菌液OD600为为1-2诱导诱导 收集菌体，重悬悬于浸染缓缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，0.015% Silwet L-77)，将菌液稀释释 至OD600为为0.6-0.8转转化 将拟拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓缓冲液的烧烧杯中，烧烧杯放置在真空罐中，0.5Mbar 抽真空10 min培养 将拟拟南芥植株平放在拖盘盘中，盖上塑料膜，避光培养。12 d后去除塑料膜，培养至 种子成熟农杆菌侵染瞬时转化烟草接种 接种含有表达载载体的农农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基 (Rif 100 g/mL，Kan 50 g/mL)中，28 C，200 rpm振荡荡培养过过夜活化 将过过夜培养的菌液按照1:100的比例转转接到50 mL新鲜鲜配制的YEP液 体培养基(Rif 100 g/mL，Kan 50 g/mL)中，28 C，200 rpm振荡荡 培养至菌液OD600为为1-2诱导诱导 5000 rpm离心5 min收集菌体，重悬悬于浸染缓缓冲液(1/2MS，5%蔗糖 ，乙酰酰丁香酮酮120mol/L)，将菌液稀释释至OD600为为0.6-0.8侵染 烟草组组培苗叶片切成小块块，浸泡在菌液中侵染10min后，用无菌滤滤 纸纸吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（MS+5%蔗糖+乙酰酰丁 香酮酮120mol/L）上（252）暗培养条件下培养2d。注射法瞬时转化烟草受体材料 种植本生烟(Nicotianabenthamiana)：25 C，16 h光照，约约一个月后可用 ；在注射的前一天将烟草浇浇水并置于黑暗条件下；接种与活化 小量培养农农杆菌16-24 h；按1:100转转接到培养液(5 mL YEP，100 M乙酰酰 丁香酮酮(Aldrich)，10 mM MES(pH 5.6)，Rif 100 g/mL，Kan 50 g/mL ）中，28 C16-24 h诱导诱导 当菌摇摇到OD6001.0时时，5 000 rpm 10 min收集菌体，用溶液(5 ml 10 mM MgCl2，7.5 L 100 mM乙酰酰丁香酮酮)重悬农悬农 杆菌至OD6001.0，室温静置 至少3 h侵染 用1 ml注射器注射烟草叶片，避光培养约约48 h后，Gus染色观观察乙酰丁香酮Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir区基因的活化具有重要作用。乙酰丁香酮（Acetosyringone，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3）AS：遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以能够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外源基因的整合。使用方法：u在侵染前4-6h加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因高度活化状态，从而提高侵染能力u悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入u加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着16h后才能进行转化u在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入ASSILWET L-77拟南芥、油菜等转化必须试剂之一，原产地为美国GE公司，Silwet-L77高效有机硅表面活性剂，能够极大的降低水的表面张力(水的表面张力为72.4mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有机硅溶液的表面张力约为21mN/m),这使Silwet-L77有机硅溶液可轻易湿润几乎所有种类的叶面,相对于传统助剂,显著提高了在靶标生物的覆盖面.同时，Silwet-L77有机硅助剂具有极强的耐水冲刷及渗透能力。Silwet-L77是拟南芥及其它作物常用的转基因用表面活性剂。植物瞬时表达系统 当外源基因导入植物细胞中以后，其表达方式有瞬时表达（transientexpression）和稳定表达（stable expression）两种。在瞬时表达状态的基因转移中，引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达，并持续约80小时左右。在稳定表达状态的基因转移中，导入宿主细胞的DNA整合到细胞染色体DNA上，以永久形式存在，并可传给后代，形成稳定的转化细胞。植物瞬时表达系统在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用途广泛。GUS基因gus基因来源于E.coli染色体上的uid A位点。编码-葡萄糖苷酸酶。u -葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。u 根据gus基因检测所用的底物不同，检测方法有：组织化学法、分光光度法和荧光法。操作要点侵染烟草叶片无菌操作注意事项抗生素的正确使用及抗生素敏感性实验新鲜的叶片转化效率高侵染前去除拟南芥已开花和果荚侵染后筛选再生植株要注意抑制农杆菌生长侵染后共培养一般为暗培养，12d，使农杆菌繁殖迅速，提高转化效率。实验报告u实验目的u实验原理（简略写）u实验方法u实验结果及分析（最重要）u思考题（最后一次课给）切勿相互抄袭，支持原创，如有雷同后果自负 ！