B.1 两步法 急性毒性（口饲）-固定剂量方法1. 方法1.1. 引言见总述 B 部分 A。1.2. 定义见总述 B 部分 B1.3. 注释无。1.4. 测定方法的原理急性毒性口饲方法能测定摄取一定剂量测定物质在短时间内的副作用。确定剂量方法分两个阶段进行。在预备的测定阶段，强制性给同种同性动物样品口饲的不同剂量的作用都顺序地调查记录下来。通过该阶段能得到剂量与毒性的关系，包括估计的最小的致死剂量。一般情况下，所用动物样品的数量不超过 5 只。在主要的实验阶段，测定物质以预设剂量之一（5,50,500 或2000mg/kg）分别口饲给 5 个雄性动物组和 5 个雌性动物组。根据预备阶段的结果使用剂量并且要有利于在动物身上产生明显毒性却不致死。依据实验步骤，观察产生的作用。当初始剂量水平能产生明显中毒，但无致死现象时，就不需要进一步测定了。当所使用的剂量未产生明显中毒，测定物质就需要使用更高的剂量重新测定；相反，如果动物死亡或发生严重中毒以至需要人道宰杀动物时，测定物质就需要使用更低的剂量重新测定。此实验步骤允许“差别剂量”鉴定（见 1.2.定义） 。这是不会引起死亡（包含人道宰杀）的最高预定剂量。如果动物表现的很悲伤或承受巨大的疼痛，就需要安乐死。由于腐蚀和刺激的特性而能引起明显的疼痛的化学品，剂量测试因此无须被实行。1.5.质量标准无 1.6.测定方法的描述1.6.1.准备1.6.1.1.实验的动物如果没有特别说明，小白鼠是用来实验的最佳选择。使用实验室普遍使用的种类。在实验的开始阶段，对不同性别，所使用动物样品的体重范围应该不超过规定的体重的20%。在实验进行前，将动物在实验室里喂养至少五天。实验开始前将健康的成年动物随机打乱，然后分成供观测实验和主要实验使用的一系列的实验组。事实上，每种性别只有一组在主要实验中使用。1.6.1.2.药剂的准备和使用必要时，将实验物质溶解或悬浮在适当的媒介物中。最好在可能的情况下首先考虑使用水溶液，接着考虑使用菜油溶液，然后考虑其他的合适的溶液或悬浮液。对于非水溶液在实验前或实验同时应了解或测定出它的毒性。对于鼠类动物，药剂的使用量不要超过10ml/kg（药剂量/体重） ，水溶液也可用 20ml/kg 的使用量。实验中药剂的用量应该尽可能的减少，通过调整溶度以保证其在所有药品的规定使用量内。在药品的使用前动物需要禁食。对于鼠类，喂的食物不能是隔夜的，水的用量没有限制。第二天需要测量动物样品的体重，接着将实验的物质配成单一剂量来使用。如果单一剂量很难达到作用，可以在不超过 24 小时的时间内将药剂分成更小的份量来使用。在实验物质被使用后的 3-4 小时后，可以不喂食。当被分成小份量的药剂在一段时间内使用时，有必要依据这段时间的长短来给动物提供食物和水。1.6.2.实验过程1.6.2.1.观察实验不同药剂的作用可以通过对一种的动物研究表现出来。由于雄性动物样品的一般都比雌性动物更加敏感些，一般的，雌性动物被用在研究动物对信息刺激的迟钝上。需要连续用药，每种动物至少需要用药 24 个小时。仔细观察所有动物对毒物的反应至少七天；如果适度的毒性反应持续了 7 天，那么这只动物需要继续再被观察 7 天。以下几种级别的初始的药剂用量被考虑使用:5，50，500 和2000mg/kg。如果所选的一种初始用量没有导致强烈的药物反应而高一级的又导致了死亡，那么可以选择一种或多种两等级之间的合适的量来进行研究。在使用这种方法时有必要建立一些信息，关于何种等级的用量导致对毒药的反应,以及最少的可以导致死亡的用量。需要用一种方法通过相关化学物的证据来选择初始用量。如果缺乏这样的信息，一般建议在第一例中使用 500mg/kg 的用量。如果初始用量没有引起毒药反应，接着用更多的用量来实验。如果在2000mg/kg 都没有出现死亡率，观测实验就结束了，接着从这一用量开始进行主要测定。如果反应很强，出于人道主义一般在初始用量（比如 500mg/kg）将其宰杀 ,接着将较低的用量（比如 50mg/kg）用在下一只动物身上。如果这只动物存活下来了，以后的动物可以用两种用量之间的用量。一般在一次实验过程中，不使用超过 5 只的动物。1.6.2.2.主要实验每一级被用来研究的药剂的用量一般都用至少 10 只动物（5 只雌的，5 只雄的）来实验。雌的必须没怀孕而且没生育过。在进行主要实验时用适宜的用量作为原则。禁止使用会使被测动物致死的剂量。在测定中使用的药剂的量必须从四种规定药量的等级中选择，为5，50，500 或者 2000mg/kg。选择的初始用量应该可以产生明显的毒药反应但不能造成过高死亡率（包括人道的宰杀；意外死亡可以不包括但必须记载下来） 。当该剂量既可以产生明显的毒物反应又不会造成高死亡率，就可以不必做进一步的测定了。当选择的药剂等级没有产生明显的毒性反应，该药剂不能再用高一级的用量使用。可是动物应该继续被观察直到观察期结束。当剧烈的毒性反应导致需要采取人道宰杀或者造成了高死亡率，该药剂可以在低一级的用量中使用。同样，不需要人道宰杀的动物需要继续被观察直到观察期满。根据使用，需要有系统进行观察并记录下来。每个记录结果对应每个动物。观察期至少得 14 天。但是观察时间不能够硬性的规定。它应该根据对毒药的反应，发作率以及痊愈时间进行考虑；有必要时可以延长。毒性出现和消失的时间以及死亡的时间非常重要，尤其是有一个趋势使得毒性信号被推迟。在用药期间每天至少有 2 次仔细的临床检查，在用药后每天至少一次。明显十分疼痛的动物或者表现得非常痛苦的动物要人为的宰杀。如果给药后的几天里动物仍表现出毒性的反应，额外的观察则十分的必要。如果表明开始的用量太高的话则测定应该结束。观察的内容还包括皮肤、粘膜以及呼吸系统、循环系统、周围神经系统和中枢神经系统，生理活动以及行为的变化。应该对颤栗、痉挛、唾液分泌、腹泻、昏睡、麻痹和昏迷等现象尤其要关注。在测定药物使用前的短时间内需对动物个体的体重进行测量，需要持续几天或几星期每天测量。在实验中死亡的动物以及一直活到实验结束的动物需要验尸或测体重。全部的病理的变化都需要纪录下来。如果有指示，组织需要拿去做组织病理的测定。在特殊情况下，根据先前的药剂用量，对第二第三的药剂用量的测定也是需要的。如果药剂在 5mg/kg 的体重的用量下也导致高死亡率（或者观测实验表明在那种剂量下会导致高死亡率） ，那么这种具有急性中毒的物质需要进一步的研究。2.实验数据从观测实验以及主要实验中得出的实验数据需要被总结在表格里，用来表明在开始实验时每种等级药量所用的动物样品的数目；对毒性有所表现的动物样品的数目；死亡的动物样品的数目，包括在实验过程中死掉的和因人道主义而宰杀的；在主要实验中的对毒性作用的描述和与混合物有关的毒性是否被观测到；毒性性物质作用的时间长短；以及被发现尸体的量。存活超过一天体重的变化必须被计算和记录下来。由于十分的痛苦而被人道的宰杀的动物需要被记录下来作为一种复杂原因的死亡。3.实验结果报告3.1.测定结果报告如果可能的话观测实验和主要测定的实验结果报告应当的包括以下信息：- 动物种类，品系，来源，环境条件，饮食等等。- 测定条件- 药剂用量器具（如果使用）和浓度- 所有剂量的观测结果。- 包含性别和剂量响应实验数据的表格（例如，所使用的动物样品的数量；体重变化；可能的话，还包括在测定中自然死亡和人为杀死的动物数量；有中毒迹象的动物数量；药物的特性，过敏性和作用的持续性）- 中毒反应的时间进程以及是否存在相反的情况- 动物死亡或被宰杀的时间，以及使用药剂后动物存活的时间，还包括人道宰杀的原因和标准。- 验尸发现- 组织病理上相关的发现- 结果的讨论- 测定结果的解释，包括确诊的中毒迹象和测定中药剂用量的关系。3.2. 实验结果评估和解释剂量5mg/kg.b.w50mg/kg.b.w500mg/kg.b.w2000mg/kg.b.w结果少于 100%的存活率100%存活率，但中毒明显100%存活率，无明显中毒现象少于 100%的存活率100%存活率，但中毒明显100%存活率，无明显中毒现象少于 100%的存活率100%存活率，但中毒明显100%存活率，无明显中毒现象少于 100%的存活率100%存活率，无明显中毒现象或中毒明显解释剧毒物质毒性物质参照 50mg/kg.剂量的解释可能是毒性或剧毒。参照5mg/kg.b.w有害物质参照 500mg/kg.b.w毒性或有害物质。参照50mg/kg.b.w无明显毒性物质参照 2000mg/kg.b.w参照 500mg/kg.b.w无明显毒性物质也可以参照总述 Part B (D)4. 注释见总述 PartB(E)