1、 取组织块（0.2g1g）最少可到 25mg ，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入 5 或 10ml 的小烧杯内2、用移液管量取预冷的匀浆介质（ph7.4,0.01mol/L Tris-HCL, 0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L 蔗糖 0.8的氯化钠溶液）或者用 0.86冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的 9 倍，用移液管或移液器取总量的 2/3 的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中） 。3、匀浆的方式有多种：手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反复冻融。手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（68分钟） ，充分研碎，使组织匀浆化。机器匀浆：用组织捣碎机 1000015000r/min 上下研磨制成 10组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 35 次，在冰水中进行） ，皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用 40 安培，5 秒/ 次，间隙 10 秒反复 35 次。反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右） ，但有部分酶活力会受影响。取少量组织匀浆做涂片（直接涂片、染色均可） ，显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可以延长匀浆时间或增加冻融次数。4、将制备好的 10匀浆用普通离心机或低温低速离心机 3000r/min 左右离心1015 分钟，若检测 ATP 酶，则只需要 1000 转/分，离心 5 分钟，将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种测定TRIzol 试剂适用于从细胞和组织中快速分离 RNA。TRIzol 试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS 法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的 RNADNA蛋白质 .TRIzol 使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有 RNase 抑制剂可保持 RNA 的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA 在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收 RNA；用乙醇沉淀中间层可回收 DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol 试剂可用于小量样品（50100mg 组织、510 6 细胞）也适用于大量样品（1g 组织、107 细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总 RNA 无蛋白质和 DNA 污染，可用于 Northern Blot，dot blot，ployA 筛选，体外翻译，RNase 保护分析和分子克隆。在用于 RT-PCR 时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无 RNase 的 DNase 处理 RNA 样品，避免出现假阳性。共纯化的 DNA 可用作标准，比较不同样品 RNA 的得率，也可用于 PCR 和酶切。蛋白质可用于 Western Blotting。 规格：100ml 黄色透明液体储存条件：28 避光保存 12 个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。 预防 RNase 污染注意事项： 1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为 RNase 的来源。 2.使用灭过菌的 RNA 专用塑料制品避免交叉污染。 3.RNA 在 TRIzol 试剂中时不会被 RNase 污染，但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150 烘烤 4 小时，塑料制品可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除 RNase。 4.配制溶液应使用无 RNase 的水（将水加入处理过不含 RNase 的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度 0.01v/v，放置过夜，高压灭菌注：DEPC 有致癌之嫌，需小心操作）。RNA 的提取1. 匀浆处理：a. 组织将组织在液氮中磨碎，每 50100mg 组织加入 1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过 TRIzol 体积 10。 b. 单层培养细胞 直接在培养板中加入 TRIzol 裂解细胞，每 10cm2 面积（即 3.5cm 直径的培养板）加 1ml，用移液器吸打几次。TRIzol 的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol 加量不足可能导致提取的 RNA 有 DNA 污染。 c.细胞悬液离心收集细胞，每 51010 6 动物、植物、酵母细胞或 1107 细菌细胞加入 1mlTRIzol，反复吸打。加 TRIzol 之前不要洗涤细胞以免 mRNA 降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2.将匀浆样品在室温（1530）放置 5 分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于 28 10000g 离心 10 分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量 DNA，上清中含有 RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。4. 每使用 1ml TRIzol 加入 0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温放置 3 分钟。5. 2-810000g 离心 15 分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA 主要在水相中，水相体积约为所用 TRIzol 试剂的 60。6. 把水相转移到新管中，如要分离 DNA 和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的 RNA。每使用 1mlTRIzol 加入 0.5ml 异丙醇，室温放置 10 分钟。7. 28 10000g 离心 10 分钟，离心前看不出 RNA 沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。8. 用 75乙醇洗涤 RNA 沉淀。每使用 1ml TRIzol 至少加 1ml 75乙醇。28不超过 7500g离心 5 分钟，弃上清。9.室温放置干燥或真空抽干 RNA 沉淀，大约晾 510 分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致 RNA 的溶解性大大降低。加入 25200l 无 RNase 的水或 0.5SDS，用枪头吸打几次，5560 放置 10 分钟使 RNA 溶解。如 RNA 用于酶切反应，勿使用 SDS 溶液。 RNA 也可用 100的去离子甲酰胺溶解，-70保存。注意事项： 1. 从少量样品（ 110mg 组织或 10210 4 细胞）中提取 RNA 时可加入少许糖原以促进 RNA 沉淀。例如加 800mlTRIzol 匀浆样品，沉淀 RNA 前加 510gRNase-free 糖原。糖原会与 RNA 一同沉淀出来，糖原浓度不高于 4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响 PCR 反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60 至-70保存至少一个月。RNA 沉淀可以保存于 75% 酒精中 28 一星期以上或 -5 至-20 一年以上。 3. 分层和 RNA 沉淀时也可使用台式离心机，2600g 离心 3060 分钟。预期产量：1mg 组织或 1106 细胞提取 RNA 分别为： 肝和脾 610g ，肾 34g ，骨骼肌和脑组织 11.5g ，胎盘 14g ，上皮细胞 815g ，成纤维细胞 57g 。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底。B.RNA 沉淀未完全溶解。A260/A28012000g 离心 10 分钟除去。 DNA 的定量：取一份溶于 8mMNaOH 的 DNA 加水测 A260 值。一单位 A260 值相当于 50g/ml双链 DNA。根据 DNA 产量可估计细胞数，人、大鼠、小鼠 1106 二倍体细胞含 DNA 的量分别为 7.1g，6.5g，5.8g 。预期产量：1mg 组织或 1106 细胞提取 DNA 分别为肝和肾 34g 骨骼肌，脑组织，胎盘 23g 人，大鼠，小鼠培养细胞（110 6）5 7g 成纤维细胞 57g。应用：1. 用于 PCR 溶于 8mM NaOH 的 DNA 用 0.1M HEPES 调 pH 至 8.4，取 0.11g DNA 用作模板。 2. 酶切反应用 HEPES 或 1mM EDTA 调节 pH 至适当值。每 g DNA 使用 35 单位的酶，80 90%的DNA 是可消化的。 1ml 8mM NaOH 溶解的 DNA 样品 pH 值调节Final pH 0.1M HEPES（l ） Final pH 1M HEPES（l） 8.4 86 7.2 23 8.2 93 7.0 32 8.0 101 7.8 117 7.5 159注意事项： 1. DNA 在中间层和有机相中时可在 28保存过夜。 2.DNA 沉淀在 75%乙醇中 28 可保存几个月。 3.DNA 在 8mM NaOH 溶液中 4可放置过夜，如长期保存需用 HEPES 调节 pH 至 78 并且加 EDTA 至 1mM，可置于 4或-20长期保存。常见问题分析：得率低：A.样品匀浆和裂解的不彻底。B.最终得到的 DNA 沉淀没有完全溶解。A260/A2801.70 ：A. 检测吸光度时，RNA 样品没有溶于水，而溶于了 TE 中。B.酚除去的不彻底，可用 0.1M 柠檬酸钠（含 10%乙醇）再洗一遍 DNA 沉淀。DNA 降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻。B.待提取 RNA 的样品没有保存于 -60 至-70，而保存在了-5 至-20。C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪。RNA 污染：A.氯仿分层后水相去除的不干净。B.DNA 沉淀用 0.1M 柠檬酸钠（含 10%乙醇）洗的不彻底。蛋白质的提取准备试剂：异丙醇含 0.3M 盐酸胍的 95%乙醇无水乙醇 1%SDS。操作步骤： 1.取沉淀 DNA 后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用 1ml TRIzol 加 1.5ml 异丙醇，室温放置 10 分钟， 28 12000g 离心 10 分钟弃上清。2.用含 0.3M 盐酸胍的 95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用 1mlTRIzol 加 2ml 洗涤液，室温放置 20分钟，2 8 7500g 离心 5 分钟，弃上清，重复两次。用 2ml 无水乙醇同样方法再洗一次。3.真空抽干蛋白质沉淀 510 分钟，用 1%SDS 溶解蛋白质，反复吸打，50温浴使其完全溶解，不溶物 28 10000g 离心 10 分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于 Western Blot 或-5 至-20保存备用。注意事项： 1. 蛋白质沉淀可保存在含 0.3M 盐酸胍的 95%乙醇或无水乙醇中 28 一个月以上或-5 至-20一年以上。 2. 用 0.1% SDS 在 28 透析三次，10000g 离心 10 分钟取上清即可用于 Western Blot。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底。B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。电泳时条带变形：蛋白质沉