1/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素实验122 薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.1 实验目的(1) 掌握有机溶剂提取天然产物的原理和操作方法。(2) 掌握薄层色谱法分离原理和实验技术。2/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.2 实验原理植物叶片中的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、-胡萝卜素及叶黄素等四种。 叶绿体色素是脂溶性色素，植物叶绿体色素通常可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。在波长662 nm、644 nm测定吸光值，可根据公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量。通过薄层色谱(TLC)对叶绿体色素提取液进一步分离，可分离叶绿素a、叶绿素b、-胡萝卜素及去镁叶绿素，经多次制备可得少量叶绿素纯品，并进行光谱表征。3/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.3 实验步骤1. 大叶黄杨叶片预处理：2. 叶绿体色素的提取： 称取1 g预处理过的大 叶黄杨叶片 边加入提取剂 边快速 研磨叶片 量取30 mL提取剂(95%乙醇)研磨约10 min 通风橱中 用不锈钢网滤去残渣 得到提取液 剪细碎 置于研钵 采集新鲜成熟大叶 黄杨叶若干 投入沸水中 不断搅拌30 s 凉水中冷却 迅速捞起分批用滤纸吸干叶片表面水分 清水洗净4/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素(1)提取液的粗提纯：(2)提取液的进一步提纯：粗提纯的 提取液 离心管 用保鲜膜盖住管口 1000 rad/min转速离心10 min 取其上层清液 避光保存较纯的色素 提取液转入25 mL 容量瓶中用石油醚 定容测量其在662 nm、 644 nm的吸光值 0.5 cm 比色皿 分液漏斗15 mL石油醚上步的提取液 静置30s 5 mL饱和食盐水15 mL蒸馏水 分层 分去 下部水层5 mL饱和食盐水分去 下部水层转入棕色瓶 中保存 提取液 得到15 mL蒸馏水5/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素硅胶G薄层 板活化 硅胶G薄 层板100120 烘箱 烘3060 min 干燥箱中 保存 (2) 点样 取硅胶G薄 层板 板一侧距底边1.5 cm处画 一条横线作为起点线 起点线以上12 cm处画一 条横线作为终点线 用干燥干净的 玻璃毛细管在 起点线处点样 晾干 溶剂挥发后轻触 67次 斑点直径尽量小 3. 叶绿体色素的分离: (1) 硅胶G薄层板活化及层析液的制备：层析液的 制备 层析缸 10 mL丙酮石油醚轻轻振荡盖上层析缸盖静置 10 15 min(23)层析液6/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素(3) 展开：(4) 鉴定：液面不能 超 过点样线 点好样的 硅胶玻片 层析缸 盖好盖子 进行上行层析 待展开剂上升到终点线 附近时(约2030 min) 取出并在通风橱内晾干 要尽可能多地分 离叶片各种色素观察各斑点的颜色 计算比移值Rf Rf =样品中某组分移动离开原点的距离展开剂前沿距原点中心的距离7/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素4. 叶绿体色素的光谱表征：将层析板上分开的 叶绿素a和叶绿素b的色带 分别用干净刮刀 刮入试管 5 mL 80%丙酮溶液 通过紫外可见光谱法 进行定性鉴定 提取 橙黄色-胡萝卜素灰色的去镁叶绿素蓝绿色的叶绿素a黄绿色的叶绿素b自上而下8/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.4 注意事项(1) 研磨叶片时要将其尽量剪碎，使叶片得到充分研磨；研磨至叶片发白为止。(2) 层析液倒入层析缸后，盖上盖子，让其气相饱和10 min以上，否则分离效果不佳。(3) 薄层色谱点样时，尽量使斑点小，直径不超过5 mm，若斑点颜色较浅，可反复点直至其呈深绿色。(4) 大叶黄杨叶薄层色谱分离一般可得橙黄色-胡萝卜素、灰色的去镁叶绿素、蓝绿色的叶绿素a及黄绿色的叶绿素b色带。9/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.5 问题讨论(1) 绿色植物叶片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？(2) 薄层色谱分离色素原理是什么？(3) 试比较叶绿素a、叶绿素b和-胡萝卜素的极性，为什么-胡萝卜素在薄层板上移动最快？10/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素122.6 参考答案(1) 绿色植物叶片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？答：色素主要成分有脂溶性和水溶性色素，脂溶性色素主要为叶绿素与类胡萝卜素，水溶性色素主要为花色甙类，又称花青素。提取液可能含脂溶性色素。11/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素(2) 薄层色谱分离色素原理是什么？答：薄层色谱分离色素原理是利用不同色素在各种有机溶剂中的分配系数或在吸附剂上的吸附能力的不同，当它们通过薄层板时，这种分配或吸附过程反复多次 地进行，最后将它们一一分离开来。12/12在线答疑：wy-fxhx163.com chenh113hfuu.edu.cn大 学 通 用 化 学 实 验 技 术薄层色谱法分离鉴定叶绿素(3) 试比较叶绿素a、叶绿素b和-胡萝卜素的极性，为什么-胡萝卜素在薄层板上移动最快？答：极性：叶绿素b叶绿素a-胡萝卜素；-胡萝卜素在层析液中的溶解度大，对薄层板的吸附能力小，所以移动最快。