L o g o亲和层析纯化技术要点6th Group小组成员:徐鹏，蒋美玲，季成，滕嘉琳， 金爽，任沛L o g ov生物制药工艺上主要运用的几种色谱技术分配色谱吸附色谱 离子交换色谱亲和色谱凝胶色谱6th GroupL o g oAffinity Chromatography亲和层析技术概述1亲和层析基本过程2His-tag亲和层析常见问题3Tips46th GroupL o g o亲和层析技术概述vWhat is Affinity Chromatography? 亲和层析是利用生物体中多数大分子物质具 有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性 而建立的分离纯化技术 其专一性是由分子有关作用基团（官能团） 的化学结构与它们的空间排列决定的 亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生 物太分子最重要的方法之一6th GroupL o g oBackground生物大分子自身的特殊性和复杂性：热稳定性差 ，对环境的pH值、有机溶剂、某些无机载体和金 属离子很敏感。因此欲高效分离纯化存在于相当大体积的组织匀 浆或发酵液中的极少量目标产物，同时又混有大 量理化性质相仿的其它生物活性物质时，仅根据 理化性质不同设计分离纯化工艺已远不能满足生 物技术发展的需要。这时就必须从生物亲和作用 力的角度进行研究，而亲和技术正是在此背景下 产生的。6th GroupL o g o聚苯乙烯载聚苯乙烯载 体连接上抗体连接上抗 原，分离血原，分离血 液中相应的液中相应的 抗体抗体用淀粉装柱用淀粉装柱 来分离淀粉来分离淀粉 酶酶第一第一 次认识到亲次认识到亲 和层析和层析琼脂糖载体取代聚苯琼脂糖载体取代聚苯 乙烯载体，使亲和层乙烯载体，使亲和层 析得到高速发展，成析得到高速发展，成 为为“ “第二大类第二大类” ”分离分离 纯化手段，应用广泛纯化手段，应用广泛 ，亲和对众多。，亲和对众多。亲和层析发展史1910191019551955196719676th GroupL o g o基本概念v亲和作用：生物物质具有识别特定物质并 与该物质分子结合的能力，且可以区分结 构与性质相似的其他分子，这种特异性的 相互作用称为亲和作用。 v配基:亲和层析中能被某一生物大分子识别 和可逆结合的生物专一性物质。 v配体：与配基是相对的概念。6th GroupL o g ov配基应具备的特性： v1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 v2.必须具备能被修饰的功能基团常见配基-配体物质对：酶-底物 酶-抑制物 激素-受体 抗原-抗体 金属离子-氨基酸残基 cDNAcDNA- -对应的基因片段，等对应的基因片段，等6th GroupL o g o亲和层析的特点亲和层析通用性差，洗脱不缓和通用性差，洗脱不缓和高度特异性高度特异性高效能操作简便快速亲和力缓和应用广泛6th GroupL o g o亲和层析基本过程配基固定化(Immobilise)基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结 合,使其固相化的物质。6th GroupL o g o吸附(Adsorption)洗脱 (Elution )6th GroupL o g o洗脱 elution洗涤 wash上样 Sample applic.平衡 equilibration6th GroupL o g o6th GroupL o g o洗脱方法非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度 、介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗 脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复 到天然结构 特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱 和配基专一作用的蛋白质，不洗脱由于非专一 吸附上去的杂蛋白6th GroupL o g o6th GroupL o g o亲和层析的基本类型v生物亲和层析 v免疫亲和层析 v金属离子螯合亲和层析 v染料亲和层析 v拟生物亲和层析6th GroupL o g o金属离子螯合亲和层析v金属离子螯合亲和层析是利用金属离子的 络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分 离系统。Ni Sepharose 6 Fast Flowv含His-tag的rhEGF： His的咪唑基可以与 Ni2+特异性结合。6th GroupL o g o6th GroupL o g o常见问题1 1纯化的组分中没有 His标签的蛋白?2 23 3样品黏度太大？层析柱堵塞？6th GroupL o g oTips一些从实验手册里总结出来的Tips v1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如 ：NH4+，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等； v2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA， EGTA，等等； v3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原，比如 DTT，防止二价Ni被还原； v4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流 失； v5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比 如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；6th GroupL o g ov6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏 水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%（v/v） v7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质； v8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间； v9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿 素（最高可8M） v10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween， NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去 除核酸污染； 6th GroupL o g oClick to edit company slogan .6th GroupL o g o一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了 v可能原因1：超声的功率不对(太大，蛋白炭化， 太小，蛋白没有释放) 策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶v可能原因2：样品或者是结合缓冲液不正确 策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确 保在溶液 中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓 度不是太高。6th GroupL o g o一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了v可能原因3：组氨酸的标签没有完全的暴露 策略：在变性条件下(用48 M 脲，或46 M盐 酸胍)进行纯化。v可能原因4：His标签丢失 策略1：WB或者anti-his的抗体检查His是否表达 ，上游构建，改变his-tag的位置(C-terminal or N- terminal)，必要时增加his个数(常用6-10个)。 策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的 时间。 策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合 金属离子。6th GroupL o g o二、His标签蛋白与Ni2+结合了，没有被洗脱下来v 可能原因：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上， 结合力较强） 策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。v 可能原因：蛋白已沉淀在柱上 策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋 白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下 洗脱(用48 M脲，或46 M 盐酸胍)。v 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应 策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的浓度。6th GroupL o g o层析柱堵塞v可能原因：细胞碎片 v解决方案：离心或者用0.22m的滤膜过滤 发酵液6th GroupL o g o样品黏度太大？v可能原因：宿主细胞的核酸含量太高 v解决办法：继续超声破碎，直至黏度降 低6th Group