海洋生物学专业毕业论文海洋生物学专业毕业论文 精品论文精品论文 东海原甲藻增殖细胞核抗东海原甲藻增殖细胞核抗原基因表达量与生长关系的研究原基因表达量与生长关系的研究关键词：东海原甲藻关键词：东海原甲藻 增殖细胞核增殖细胞核 抗原基因表达抗原基因表达摘要：浮游藻是海洋食物链的重要一环，在能量转移和营养盐循环等方面起着 重要作用。对浮游藻现场生长率等基本生理生态学参数的测定，是估算浮游藻 生产力、研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测的基础，特 别是现场测定单种浮游藻的生长率显得尤为重要。但目前尚缺乏一种准确估算 单一种类浮游藻现场生长率的方法。近年来，国际上对细胞周期标志物的研究 显示，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)可能在 浮游藻生长率研究中有巨大的潜在应用价值，这为藻类生长率的估算提供了新 的研究方向。 本研究以我国东海海域常见的赤潮藻-东海原甲藻 (Prorocentrumdonghaiense)为研究对象，首次克隆得到了东海原甲藻的 PCNA 基因和其细胞色素 b 基因的 cDNA 全长序列，分别设计了符合实时荧光定量 PCR 检测要求的引物和 TaqMan 探针，建立了检测东海原甲藻 PCNA 与 Cytb 基因的实 时荧光定量 PCR 方法，系统研究了东海原甲藻 PCNA 基因表达量在不同细胞周期 中的变化及其与生长率之间的关系，为运用分子生物学技术实现东海原甲藻现 场生长率的估算奠定了基础。 主要研究结果如下： (1)通过反转录 PCR(RT-PCR)和 cDNA 末端快速扩增技术(RACE)，首次克隆得到了东海原甲藻长 为 1057bp 的 PCNA 基因的 cDNA 全长序列和长为 1124bp 的细胞色素 b(cytochrome b，Cyt b)基因的 cDNA 全长序列，并分别对 PCNA 和 Cyt b 进行 了序列比对和系统进化树分析。 (2)根据得到的 PCNA 与 Cyt b 基因序列，分 别设计了符合实时荧光定量 PCR(RFQ-PCR)检测要求的引物和 TaqMan 探针，并 以 12 种藻为参照藻，对所设计 PCNA 基因的 RFQ-PCR 引物的特异性进行了分析。 采用 SYBR Green染料和 TaqMan 探针两种荧光体系建立了检测东海原甲藻 PCNA 与 Cyt b 基因的实时荧光定量 PCR 的标准曲线。采用 SYBR Green染料体 系得到的曲线方程分别为：对 PCNA，y=-3.403x+40.048，(r=0.999，其中 x 为 细胞数对数值，y 为 CT 值，r 为相关系数)；对 Cyt b，y=- 3.501x+39.351，(r=0.999)；采用 TaqMan 探针体系得到的曲线方程分别为：对 PCNA，y=-3.211x+39.302，(r=0.999)；对 Cyt b，y=- 3.340x+41.041，(r=0.997)。通过对标准样品的检测，验证了所建立标准曲线 的准确性。 (3)运用建立的定量 PCR 方法，系统研究了东海原甲藻 PCNA 基因 表达量在不同细胞周期中的变化及其与生长率之间的关系。结果表明，Cyt b 基因表达稳定，平均单细胞表达量为(45.44.7)拷贝，在不同的生长阶段表达 量变化很小，是一个潜在的良好的内参基因。与此不同，平均单细胞中 PCNA 表 达量在培养的不同阶段变化较大，指数期的含量比平台期高 4 倍左右，说明 PCNA 表达量与细胞分裂密切相关。以 Cytb 基因为内参基因，PCNA 基因为目的 基因，进一步研究了不同培养条件下 PCNA 基因的相对表达量(REL)与生长率之 间的关系，结果发现，REL 与生长率呈正相关性。 (4)以流式细胞术分析了 同步培养的东海原甲藻的细胞周期，以 RFQ-PCR 测定了 PCNA 基因表达量，研究 了不同细胞周期中 PCNA 基因表达的变化。结果表明，同其他物种的 PCNA 类似， 东海原甲藻 PCNA 表达与细胞周期相关，表达量从 G1 后期开始升高，在 S 期表达量最高。 本研究为建立 PCNA 相对表达量与东海原甲藻生长率之间的关系， 进而运用分子生物学技术实现东海原甲藻现场生长率的估算奠定了基础。正文内容正文内容浮游藻是海洋食物链的重要一环，在能量转移和营养盐循环等方面起着重 要作用。对浮游藻现场生长率等基本生理生态学参数的测定，是估算浮游藻生 产力、研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测的基础，特别 是现场测定单种浮游藻的生长率显得尤为重要。但目前尚缺乏一种准确估算单 一种类浮游藻现场生长率的方法。近年来，国际上对细胞周期标志物的研究显 示，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)可能在浮 游藻生长率研究中有巨大的潜在应用价值，这为藻类生长率的估算提供了新的 研究方向。 本研究以我国东海海域常见的赤潮藻-东海原甲藻 (Prorocentrumdonghaiense)为研究对象，首次克隆得到了东海原甲藻的 PCNA 基因和其细胞色素 b 基因的 cDNA 全长序列，分别设计了符合实时荧光定量 PCR 检测要求的引物和 TaqMan 探针，建立了检测东海原甲藻 PCNA 与 Cytb 基因的实 时荧光定量 PCR 方法，系统研究了东海原甲藻 PCNA 基因表达量在不同细胞周期 中的变化及其与生长率之间的关系，为运用分子生物学技术实现东海原甲藻现 场生长率的估算奠定了基础。 主要研究结果如下： (1)通过反转录 PCR(RT-PCR)和 cDNA 末端快速扩增技术(RACE)，首次克隆得到了东海原甲藻长 为 1057bp 的 PCNA 基因的 cDNA 全长序列和长为 1124bp 的细胞色素 b(cytochrome b，Cyt b)基因的 cDNA 全长序列，并分别对 PCNA 和 Cyt b 进行 了序列比对和系统进化树分析。 (2)根据得到的 PCNA 与 Cyt b 基因序列，分 别设计了符合实时荧光定量 PCR(RFQ-PCR)检测要求的引物和 TaqMan 探针，并 以 12 种藻为参照藻，对所设计 PCNA 基因的 RFQ-PCR 引物的特异性进行了分析。 采用 SYBR Green染料和 TaqMan 探针两种荧光体系建立了检测东海原甲藻 PCNA 与 Cyt b 基因的实时荧光定量 PCR 的标准曲线。采用 SYBR Green染料体 系得到的曲线方程分别为：对 PCNA，y=-3.403x+40.048，(r=0.999，其中 x 为 细胞数对数值，y 为 CT 值，r 为相关系数)；对 Cyt b，y=- 3.501x+39.351，(r=0.999)；采用 TaqMan 探针体系得到的曲线方程分别为：对 PCNA，y=-3.211x+39.302，(r=0.999)；对 Cyt b，y=- 3.340x+41.041，(r=0.997)。通过对标准样品的检测，验证了所建立标准曲线 的准确性。 (3)运用建立的定量 PCR 方法，系统研究了东海原甲藻 PCNA 基因 表达量在不同细胞周期中的变化及其与生长率之间的关系。结果表明，Cyt b 基因表达稳定，平均单细胞表达量为(45.44.7)拷贝，在不同的生长阶段表达 量变化很小，是一个潜在的良好的内参基因。与此不同，平均单细胞中 PCNA 表 达量在培养的不同阶段变化较大，指数期的含量比平台期高 4 倍左右，说明 PCNA 表达量与细胞分裂密切相关。以 Cytb 基因为内参基因，PCNA 基因为目的 基因，进一步研究了不同培养条件下 PCNA 基因的相对表达量(REL)与生长率之 间的关系，结果发现，REL 与生长率呈正相关性。 (4)以流式细胞术分析了 同步培养的东海原甲藻的细胞周期，以 RFQ-PCR 测定了 PCNA 基因表达量，研究 了不同细胞周期中 PCNA 基因表达的变化。结果表明，同其他物种的 PCNA 类似， 东海原甲藻 PCNA 表达与细胞周期相关，表达量从 G1 后期开始升高，在 S 期表 达量最高。 本研究为建立 PCNA 相对表达量与东海原甲藻生长率之间的关系， 进而运用分子生物学技术实现东海原甲藻现场生长率的估算奠定了基础。 浮游藻是海洋食物链的重要一环，在能量转移和营养盐循环等方面起着重要作 用。对浮游藻现场生长率等基本生理生态学参数的测定，是估算浮游藻生产力、研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测的基础，特别是现场 测定单种浮游藻的生长率显得尤为重要。但目前尚缺乏一种准确估算单一种类 浮游藻现场生长率的方法。近年来，国际上对细胞周期标志物的研究显示，增 殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)可能在浮游藻生 长率研究中有巨大的潜在应用价值，这为藻类生长率的估算提供了新的研究方 向。 本研究以我国东海海域常见的赤潮藻-东海原甲藻 (Prorocentrumdonghaiense)为研究对象，首次克隆得到了东海原甲藻的 PCNA 基因和其细胞色素 b 基因的 cDNA 全长序列，分别设计了符合实时荧光定量 PCR 检测要求的引物和 TaqMan 探针，建立了检测东海原甲藻 PCNA 与 Cytb 基因的实 时荧光定量 PCR 方法，系统研究了东海原甲藻 PCNA 基因表达量在不同细胞周期 中的变化及其与生长率之间的关系，为运用分子生物学技术实现东海原甲藻现 场生长率的估算奠定了基础。 主要研究结果如下： (1)通过反转录 PCR(RT-PCR)和 cDNA 末端快速扩增技术(RACE)，首次克隆得到了东海原甲藻长 为 1057bp 的 PCNA 基因的 cDNA 全长序列和长为 1124bp 的细胞色素 b(cytochrome b，Cyt b)基因的 cDNA 全长序列，并分别对 PCNA 和 Cyt b 进行 了序列比对和系统进化树分析。 (2)根据得到的 PCNA 与 Cyt b 基因序列，分 别设计了符合实时荧光定量 PCR(RFQ-PCR)检测要求的引物和 TaqMan 探针，并 以 12 种藻为参照藻，对所设计 PCNA 基因的 RFQ-PCR 引物的特异性进行了分析。 采用 SYBR Green染料和 TaqMan 探针两种荧光体系建立了检测东海原甲藻 PCNA 与 Cyt b 基因的实时荧光定量 PCR 的标准曲线。采用 SYBR Green染料体 系得到的曲线方程分别为：对 PCNA，y=-3.403x+40.048，(r=0.999，其中 x 为 细胞数对数值，y 为 CT 值，r 为相关系数)；对 Cyt b，y=- 3.501x+39.351，(r=0.999)；采用 TaqMan 探针体系得到的曲线方程分别为：对 PCNA，y=-3.211x+39.302，(r=0.999)；对 Cyt b，y=- 3.340x+41.041，(r=0.997)。通过对标准样品的检测，验证了所建立标准曲线 的准确性。 (3)运用建立的定量 PCR 方法，系统研究了东海原甲藻 PCNA 基因 表达量在不同细胞周期中的变化及其与生长率之间的关系。结果表明，Cyt b 基因表达稳定，平均单细胞表达量为(45.44.7)拷贝，在不同的生长阶段表达 量变化很小，是一个潜在的良好的内参基因。与此不同，平均单细胞中 PCNA 表 达量在培养的不同阶段变化较大，指数期的含量比平台期高 4 倍左右，说明 PCNA 表达量与细胞分裂密切相关。以 Cytb 基因为内参基因，PCNA 基因为目的 基因，进一步研究了不同培养条件下 PCNA 基因的相对表达量(REL)与生长率之 间的关系，结果发现，REL 与生长率呈正相关性。 (4)以流式细胞术分