妇产科学专业毕业论文妇产科学专业毕业论文 精品论文精品论文 人胚胎干细胞诱导分化为胰人胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究岛素分泌细胞的研究关键词：糖尿病关键词：糖尿病 人胚胎干细胞人胚胎干细胞 胰岛素分泌细胞胰岛素分泌细胞 细胞分化细胞分化摘要：胰岛移植或 细胞替代是糖尿病最理想的治疗手段，但细胞来源严重匮 乏及免疫排斥反应限制了临床的广泛应用。将人胚胎干细胞(human embryonicstem cell，hESCs)诱导为胰岛素分泌细胞，成为 细胞替代物的新 资源，为解决细胞来源匮乏带来了希望。已有多种方案由 ESCs 获得胰岛素分泌 细胞，但均存在各种限制，目前仍缺乏将 ESCs 诱导分化为有功能的胰岛素分泌 细胞的最佳方案。探索诱导人 hSCs 分化为成熟且有功能的胰岛素分泌细胞，并 制定出有效而高效的分化方案，成为本课题的主要研究目的。 第一，本研究 摸索了在体外培养、扩增、冻存、复苏 hESCs 细胞株(PKU1)的条件，并对其特 异性标志物进行了检测。结果显示，hESCs 经多次传代后仍然表达 OCT-4 和 Nanog 基因，免疫荧光法显示呈 OCT-4、SSEA-4 阳性，流式细胞术分析显示， OCT-4、SSEA-4 阳性细胞比例分别达 89.38、83.44；染色体核型分析表明 为正常女性染色体核型(46，XX)。 第二，采用酶消化法分离出胎龄 14-18W 的胎儿胰岛，经悬浮培养、双硫腙(DTZ)染色后种植到组织培养皿中，再以免疫 荧光法检测一些细胞标志物的表达。结果显示，悬浮培养条件下，胎龄 14-18W 的胎儿胰岛细胞聚集成球形细胞簇，呈 DTZ 阳性，培养液中能检测到一定量的 胰岛素和 C-肽，贴壁培养后还能检测到胰岛细胞标志物 insulin 和 glucagons 及前体细胞标志物 PDX-1、CK-19 和 Nestin 的表达，证实 14-17W 胎儿胰岛已具 备一定的胰岛特性和前体细胞的特征。 第三，模拟胰腺发育分化的生理过程， 研究设计出五阶段诱导方案，具体如下：(1)撤除分化抑制因素使 hESCs 形成 拟胚体(EBs)，悬浮培养 48h；(2)将 EBs 转移至明胶包被的组织培养皿后， 加入含 Activin A 和 bFGF 及 LY294002 的诱导培养基诱导 5 天，向定形内胚 层诱导分化。RT-PCR 法鉴定 SOX17 和 FOXA2 的基因表达，与同期自发分化的 EBs 进行比较，免疫荧光法检测 SOX17 的表达。(3)将细胞转移至 laminin 包 被的培养皿，加入含 bFGF、KGF、EGF、GLP-1、尼克酰胺的低血清诱导培养基 作用 14d，向胰腺前体细胞诱导。RT-PCR 法和免疫荧光化学法分别检测前体 细胞标志物 PDX-1 及 Ngn3 表达。(4)添加含 IGF-1、betacellulin、尼克酰 胺、GLP-1、laminin 的低血清诱导培养基作用 14d，促进胰岛细胞分化，RT- PCR 法检测细胞胰岛素基因的表达，免疫荧光化学法检测分化细胞胰岛素和 C- 肽的表达。(5)将细胞转移至低黏附性培养皿中，撤除 IGF-继续培养 3 天， 促进细胞成熟。应用双硫腙(DTZ)染色液对获得的细胞团进行染色，应用 RT- PCR 法检测了胰岛素和胰高血糖素基因表达，应用 RJA 法分别测定了获得的细 胞团培养液上清和胞浆中的胰岛素、C-肽含量，并与胎儿胰岛培液上清进行比 较，静态培养胰岛素释放试验测定胰岛素与 C-肽分泌是否呈葡萄糖反应性。结 果(1)hESCs 悬浮培养 2d 后，形成类球形 EBs；(2)经第二阶段诱导后，细 胞表达 SOX17 和 FOXA2 基因，且表达量高于同期自发分化的 EBs，基本不表达 外胚层标志物 SOX1，随诱导时间延长，FOXA2 表达逐渐增强；免疫荧光化学法 显示，诱导 5 天的细胞胞核呈 SOX17。(3)经第三阶段的诱导，细胞呈上皮样 集落，RT-PCR 法检测到细胞表达 PDX-1、Ngn3 及微弱的 Pax4 基因，免疫荧光法显示细胞呈 PDX-1 阳性。(4)经第四阶段的诱导，集落中一部分细胞聚集成 多层，RT-PCR 显示，不同诱导时期均有胰岛素基因的表达，且随诱导时间延长 表达水平逐渐升高；免疫荧光显示，部分细胞呈胰岛素和 C-肽阳性。(5)经 第五阶段诱导后，hESCs 来源的细胞呈类似胎儿胰岛的胰岛样细胞簇(ICCs)， 呈 DTZ 阳性，RT-PCR 检测到 Insulin 和 Glucagon 基因表达，RIA 法检测到 ICCs 培液上清中含胰岛素与 C-肽，水平与 15-17W 胎儿胰岛培液上清相近 (P0.05)，胞浆内的胰岛素和 C-肽水平分别为 1089.2217.06IU/ml 和 181.3330.12ng/ml，静态培养胰岛素释放试验验证了 ICCs 分泌的胰岛素呈糖 反应性。 应用五阶段分化方案，hESCs 能够有效的分化为具有部分 细胞 特性和糖反应性胰岛素分泌功能的细胞，为 DM 细胞替代治疗提供了有潜力的细 胞来源和良好的临床应用前景。正文内容正文内容胰岛移植或 细胞替代是糖尿病最理想的治疗手段，但细胞来源严重匮乏 及免疫排斥反应限制了临床的广泛应用。将人胚胎干细胞(human embryonicstem cell，hESCs)诱导为胰岛素分泌细胞，成为 细胞替代物的新 资源，为解决细胞来源匮乏带来了希望。已有多种方案由 ESCs 获得胰岛素分泌 细胞，但均存在各种限制，目前仍缺乏将 ESCs 诱导分化为有功能的胰岛素分泌 细胞的最佳方案。探索诱导人 hSCs 分化为成熟且有功能的胰岛素分泌细胞，并 制定出有效而高效的分化方案，成为本课题的主要研究目的。 第一，本研究 摸索了在体外培养、扩增、冻存、复苏 hESCs 细胞株(PKU1)的条件，并对其特 异性标志物进行了检测。结果显示，hESCs 经多次传代后仍然表达 OCT-4 和 Nanog 基因，免疫荧光法显示呈 OCT-4、SSEA-4 阳性，流式细胞术分析显示， OCT-4、SSEA-4 阳性细胞比例分别达 89.38、83.44；染色体核型分析表明 为正常女性染色体核型(46，XX)。 第二，采用酶消化法分离出胎龄 14-18W 的胎儿胰岛，经悬浮培养、双硫腙(DTZ)染色后种植到组织培养皿中，再以免疫 荧光法检测一些细胞标志物的表达。结果显示，悬浮培养条件下，胎龄 14-18W 的胎儿胰岛细胞聚集成球形细胞簇，呈 DTZ 阳性，培养液中能检测到一定量的 胰岛素和 C-肽，贴壁培养后还能检测到胰岛细胞标志物 insulin 和 glucagons 及前体细胞标志物 PDX-1、CK-19 和 Nestin 的表达，证实 14-17W 胎儿胰岛已具 备一定的胰岛特性和前体细胞的特征。 第三，模拟胰腺发育分化的生理过程， 研究设计出五阶段诱导方案，具体如下：(1)撤除分化抑制因素使 hESCs 形成 拟胚体(EBs)，悬浮培养 48h；(2)将 EBs 转移至明胶包被的组织培养皿后， 加入含 Activin A 和 bFGF 及 LY294002 的诱导培养基诱导 5 天，向定形内胚 层诱导分化。RT-PCR 法鉴定 SOX17 和 FOXA2 的基因表达，与同期自发分化的 EBs 进行比较，免疫荧光法检测 SOX17 的表达。(3)将细胞转移至 laminin 包 被的培养皿，加入含 bFGF、KGF、EGF、GLP-1、尼克酰胺的低血清诱导培养基 作用 14d，向胰腺前体细胞诱导。RT-PCR 法和免疫荧光化学法分别检测前体 细胞标志物 PDX-1 及 Ngn3 表达。(4)添加含 IGF-1、betacellulin、尼克酰 胺、GLP-1、laminin 的低血清诱导培养基作用 14d，促进胰岛细胞分化，RT- PCR 法检测细胞胰岛素基因的表达，免疫荧光化学法检测分化细胞胰岛素和 C- 肽的表达。(5)将细胞转移至低黏附性培养皿中，撤除 IGF-继续培养 3 天， 促进细胞成熟。应用双硫腙(DTZ)染色液对获得的细胞团进行染色，应用 RT- PCR 法检测了胰岛素和胰高血糖素基因表达，应用 RJA 法分别测定了获得的细 胞团培养液上清和胞浆中的胰岛素、C-肽含量，并与胎儿胰岛培液上清进行比 较，静态培养胰岛素释放试验测定胰岛素与 C-肽分泌是否呈葡萄糖反应性。结 果(1)hESCs 悬浮培养 2d 后，形成类球形 EBs；(2)经第二阶段诱导后，细 胞表达 SOX17 和 FOXA2 基因，且表达量高于同期自发分化的 EBs，基本不表达 外胚层标志物 SOX1，随诱导时间延长，FOXA2 表达逐渐增强；免疫荧光化学法 显示，诱导 5 天的细胞胞核呈 SOX17。(3)经第三阶段的诱导，细胞呈上皮样 集落，RT-PCR 法检测到细胞表达 PDX-1、Ngn3 及微弱的 Pax4 基因，免疫荧光 法显示细胞呈 PDX-1 阳性。(4)经第四阶段的诱导，集落中一部分细胞聚集成 多层，RT-PCR 显示，不同诱导时期均有胰岛素基因的表达，且随诱导时间延长 表达水平逐渐升高；免疫荧光显示，部分细胞呈胰岛素和 C-肽阳性。(5)经 第五阶段诱导后，hESCs 来源的细胞呈类似胎儿胰岛的胰岛样细胞簇(ICCs)，呈 DTZ 阳性，RT-PCR 检测到 Insulin 和 Glucagon 基因表达，RIA 法检测到 ICCs 培液上清中含胰岛素与 C-肽，水平与 15-17W 胎儿胰岛培液上清相近 (P0.05)，胞浆内的胰岛素和 C-肽水平分别为 1089.2217.06IU/ml 和 181.3330.12ng/ml，静态培养胰岛素释放试验验证了 ICCs 分泌的胰岛素呈糖 反应性。 应用五阶段分化方案，hESCs 能够有效的分化为具有部分 细胞 特性和糖反应性胰岛素分泌功能的细胞，为 DM 细胞替代治疗提供了有潜力的细 胞来源和良好的临床应用前景。 胰岛移植或 细胞替代是糖尿病最理想的治疗手段，但细胞来源严重匮乏及免 疫排斥反应限制了临床的广泛应用。将人胚胎干细胞(human embryonicstem cell，hESCs)诱导为胰岛素分泌细胞，成为 细胞替代物的新资源，为解决细 胞来源匮乏带来了希望。已有多种方案由 ESCs 获得胰岛素分泌细胞，但均存在 各种限制，目前仍缺乏将 ESCs 诱导分化为有功能的胰岛素分泌细胞的最佳方案。 探索诱导人 hSCs 分化为成熟且有功能的胰岛素分泌细胞，并制定出有效而高效 的分化方案，成为本课题的主要研究目的。 第一，本研究摸索了在体外培养、 扩增、冻存、复苏 hESCs 细胞株(PKU1)的条件，并对其特异性标志物进行了检 测。结果显示，hESCs 经多次传代后仍然表达 OCT-4 和 Nanog 基因，免疫荧光 法显示呈 OCT-4、SSEA-4 阳性，流式细胞术分析显示，OCT-4、SSEA-4 阳性细 胞比例分别达 89.38、83.44；染色体核型分析表明为正常女性染色体核型 (46，XX)。 第二，采用酶消化法分离出胎龄 14-18W 的胎儿胰岛，经悬浮培 养、双硫腙(DTZ)染色后种植到组织培养皿中，再以免疫荧光法检测一些细胞标 志物的表达。结果显示，悬浮培养条件下，胎龄 14-18W 的胎儿胰岛细胞聚集成 球形细胞簇，呈 DTZ 阳性，培养液中能检测到一定量的胰岛素和 C-肽，贴壁培 养后还能检测到胰岛细胞标志物 insulin 和 glucagons 及前体细胞标志物 PDX- 1、CK-19 和 Nestin 的表达，证实 14-17W 胎儿胰岛已具备一定的胰岛特性和前 体细胞的特征。 第三，模拟胰腺发育分化的生理过程，研究设计出