儿科学儿科学( (呼吸呼吸) )专业毕业论文专业毕业论文 精品论文精品论文 TGF-/SmadTGF-/Smad 信号通路信号通路与与 ERKERK 信号通路在支气管哮喘大鼠气道重塑中的作用信号通路在支气管哮喘大鼠气道重塑中的作用关键词：哮喘大鼠关键词：哮喘大鼠 气道重塑气道重塑 信号转导信号转导 转化生长因子转化生长因子-1-1 细胞外信号调节激细胞外信号调节激 酶酶 血小板源性生长因子血小板源性生长因子摘要：目的： 1.探讨在哮喘发病机制 Smad 信号通路与 ERK(external signal regulated kinase，细胞外信号调节激酶)信号通路是否协同调控 TGF- (transforming growth factor-beta，转化生长因子-)的生物学功能。 2.研究 ERK 信号通路对大鼠 ASMC(airway smooth muscle cell，气道平滑肌细 胞)内 Smad2/3 蛋白及其 mRNA 表达的影响。 方法： 本实验首先建立哮喘 大鼠模型，后取出 ASMC 进行原代培养及传代培养，在细胞层面分组进行药物干 预研究。 1.动物实验：用卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏与激发 8 周，建 立哮喘大鼠气道重塑模型。在末次激发后 46 h 处死，取出气管及肺进行 ASMC 原代培养及传代培养，传至 4-5 代后进行药物干预。 2.细胞培养：体 外培养及鉴定大鼠气道平滑肌细胞，用 PDGF-BB(platelet-deriredgrowth factor-BB，血小板源性生长因子)、ERK 阻断剂(U0126)作为工具药干预细胞。 实验分组如下：(1)未干预组(A 组)，加无血清培养基 2ml 刺激气道平滑肌细胞 2h；(2)ERK 阻断剂(U0126)组(B 组)，分为 B1 组、B2 组、B3 组、B4 组四个亚 组，加入含 U0126 的浓度分别为 0.1mol/L，1mol/L，5mol/L，10mol/L 的 DMEM2ml 刺激气道平滑肌细 胞 2h；(3)PDGF 组(C 组)，分为 C1 组、C2 组、C3 组、C4 组四个亚组，加含 PDGF-BB 的浓度分别为 1g/L，10g/L，25g/L，50g/L 的 DMEM2ml 刺激 气道平滑肌细胞 2h；(4)PDGF+ERK 阻断剂组(D 组)，加含 PDGF-BB 和 U0126 的 浓度分别为 50g/L 和 10mol/L 的 DMEM2ml，具体用法先加入 U0126 干预细 胞 2h，吸弃细胞上清后，再加入 PDGF-BB 干预 2h。用逆转录多聚酶链反应法 (reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测 A 组，B1 组、B2 组、B3 组、B4 组，C1 组、C2 组、C3 组、C4 组，D 组 ASMC 中的磷酸化 ERK1mRNA，TGF-1mRNA 的表达；A 组，B4 组，C4 组，D 组 ASMC 中 P- Smad2，3mRNA 的表达。免疫组化法(immunohistochemistry，IHC)检测 A 组， B4 组，C4 组，D 组中 ASMC 的磷酸化 ERK1，TGF-1 及 P-Smad2/3 蛋白表达。 结果： 1.免疫组化检测 ASMC 内磷酸化 ERK1，TGF-1，磷酸化 Smad2/3 蛋 白表达： 1.1 ASMC 中磷酸化 ERK1 的 MOD 值比较 A 组 0.310.03，B4 组 0.180.05，CA 组 0.680.02，D 组 0.330.02.B4 组与 A 组比较有显著性 差异(Plt;0.01)，即 B4 组 10M U0126 刺激下 ERK1/2 磷酸化比 A 组降低； C4 组与 A 组比较有显著性差异(Plt;0.01)，即 C4 组 ERK1/2 磷酸化比 A 组升高；D 组 10M U0126 可明显抑制 PDGF-BB 刺激下的 ERK1/2 磷酸化水平(P 均lt;0.01)，与 A 组相比无显著性差异(Pgt;0.05)。 1.2 ASMC 中 TGF-1 的 MOD 值比较 A1 组 0.280.04，B4 组 0.100.02，C4 组 0.550.03，D 组 0.290.02.B4 组与 A 组比较有显著性差异(Plt;0.01)， 即 B4 组 10M U0126 刺激下 TGF-1 比 A 组降低；C4 组与 A 组比较有显著性 差异(Plt;0.01)，即 C4 组 TGF-1 LBA 组明显升高；D 组 10M U0126 可明显抑制 PDGF-BB 刺激下的 TGF-1 的表达(P 均lt;0.01)，与 A 组比较无显著性差异(Pgt;0.05)。 1.3 ASMC 中磷酸化 Smad2，3 的 MOD 值 比较 A 组 0.400.03，B4 组 0.170.02，C4 组 0.760.03，D 组 0.360.02.B4 组与 A 组比较有显著性差异(Plt;0.01)，即 B4 组 10M U0126 刺激下 Smad2/3 磷酸化比 A 组降低；C4 组与 A 组比较有显著性差异 (Plt;0.01)，即 C4 组 Smad2/3 磷酸化比 A 组升高；D 组 10M U0126 可 明显抑制 PDGF-BB 刺激下的 TGF-1 的 Smad2/3 磷酸化(P 均lt;0.01)， 与 A 组比较无显著性差异(Pgt;0.05)。 2.RT-PcR 测定 ASMC 中磷酸化 ERK1，TGF-1，磷酸化 Smad2，3 的 mliNA 表达 2.1 ASMC 中的磷酸化 ERK1mRNA 的灰度值比较 A 组 1.880.06，B1 组 0.590.04，B2 组 0.310.38， B3 组 0.150.03，B4 组 0.020.08，C1 组 2.320.06，C2 组 2.910.06，C3 组 4.040.11，C4 组 4.840.04，D 组 1.850.04. B 组 均明显低于 A 组，C 组，D 组(均 Plt;0.01)；C 组均明显高于 A 组，B 组， D 组(均 Plt;0.01)；D 组与 B 组，C 组相比有显著差异性，与 A 组差异无 统计学意义(Pgt;0.05)。 2.2 ASMC 中的 TGF-1mRNA 的灰度值比较 A 组 1.570.13， B1 组 1.560.10， B2 组 1.540.15，B3 组 1.610.17，B4 组 1.540.16，C1 组 1.600.11，C2 组 1.620.11，C3 组 1.610.08，C4 组 1.600.09，D 组 1.620.10.各组大鼠 ASMC 中 TGF- 1mRNA 的表达之间相比无统计学差异(均 Pgt;0.05)。 2.3 ASMC 中 P- Smad2mRNA 的灰度值比较 A 组 0.810.12， B4 组 0.860.11， C4 组 0.790.14，D 组 0.80.15.各组大鼠 ASMC 中 Smad2mRNA 的表达之间相比无统 计学差异(均 Pgt;0.05) 2.4 ASMC 中 P-Smad3mRNA 的灰度值比较 A 组 1.180.05，B4 组 1.150.09，C4 组 1.210.11，D 组 1.200.07.各组 大鼠 ASMC 中磷酸化 Smad3mRNA 的表达之间相比无统计学差异(均 Pgt;0.05)。 结论： 1.在哮喘发病机制中 Smad 信号通路与 ERK 信号 通路具有协同作用，协同调控着 TGF- 的生物学功能。 2.ERE 信号通路对 大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)内 Smad2/3 蛋白可能起正调控作用，对其 mRNA 可能 无作用。正文内容正文内容目的： 1.探讨在哮喘发病机制 Smad 信号通路与 ERK(external signal regulated kinase，细胞外信号调节激酶)信号通路是否协同调控 TGF- (transforming growth factor-beta，转化生长因子-)的生物学功能。 2.研究 ERK 信号通路对大鼠 ASMC(airway smooth muscle cell，气道平滑肌细 胞)内 Smad2/3 蛋白及其 mRNA 表达的影响。 方法： 本实验首先建立哮喘 大鼠模型，后取出 ASMC 进行原代培养及传代培养，在细胞层面分组进行药物干 预研究。 1.动物实验：用卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏与激发 8 周，建 立哮喘大鼠气道重塑模型。在末次激发后 46 h 处死，取出气管及肺进行 ASMC 原代培养及传代培养，传至 4-5 代后进行药物干预。 2.细胞培养：体 外培养及鉴定大鼠气道平滑肌细胞，用 PDGF-BB(platelet-deriredgrowth factor-BB，血小板源性生长因子)、ERK 阻断剂(U0126)作为工具药干预细胞。 实验分组如下：(1)未干预组(A 组)，加无血清培养基 2ml 刺激气道平滑肌细胞 2h；(2)ERK 阻断剂(U0126)组(B 组)，分为 B1 组、B2 组、B3 组、B4 组四个亚 组，加入含 U0126 的浓度分别为 0.1mol/L，1mol/L，5mol/L，10mol/L 的 DMEM2ml 刺激气道平滑肌细 胞 2h；(3)PDGF 组(C 组)，分为 C1 组、C2 组、C3 组、C4 组四个亚组，加含 PDGF-BB 的浓度分别为 1g/L，10g/L，25g/L，50g/L 的 DMEM2ml 刺激 气道平滑肌细胞 2h；(4)PDGF+ERK 阻断剂组(D 组)，加含 PDGF-BB 和 U0126 的 浓度分别为 50g/L 和 10mol/L 的 DMEM2ml，具体用法先加入 U0126 干预细 胞 2h，吸弃细胞上清后，再加入 PDGF-BB 干预 2h。用逆转录多聚酶链反应法 (reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测 A 组，B1 组、B2 组、B3 组、B4 组，C1 组、C2 组、C3 组、C4 组，D 组 ASMC 中的磷酸化 ERK1mRNA，TGF-1mRNA 的表达；A 组，B4 组，C4 组，D 组 ASMC 中 P- Smad2，3mRNA 的表达。免疫组化法(immunohistochemistry，IHC)检测 A 组， B4 组，C4 组，D 组中 ASMC 的磷酸化 ERK1，TGF-1 及 P-Smad2/3 蛋白表达。 结果： 1.免疫组化检测 ASMC 内磷酸化 ERK1，TGF-1，磷酸化 Smad2/3 蛋 白表达： 1.1 ASMC 中磷酸化 ERK1 的 MOD 值比较 A 组 0.310.03，B4 组 0.180.05，CA 组 0.680.02，D 组 0.330.02.B4 组与 A 组比较有显著性 差异(Plt;0.01)，即 B4 组 10M U0126 刺激下 ERK1/2 磷酸化比 A 组降低； C4 组与 A 组比较有显著性差异(Plt;0.01)，即 C4 组 ERK1/2 磷酸化比 A 组升高；D 组 10M U0126 可明显抑制 PDGF-BB 刺激下的 ERK1/2 磷酸化水平(P 均lt;0.01)，与 A 组相比无显著性差异(Pgt