创伤外科学专业毕业论文创伤外科学专业毕业论文 精品论文精品论文 表皮细胞去分化形成表皮表皮细胞去分化形成表皮干细胞的基础研究干细胞的基础研究关键词：表皮细胞关键词：表皮细胞 表皮干细胞表皮干细胞 去分化去分化 皮肤创伤修复皮肤创伤修复摘要：目的：从建立表皮细胞去分化模型入手，比较去分化来源的表皮干细胞 和机体自身来源的表皮干细胞在功能和生物学特性等方面的异同点，为实现无 延迟、无瘢痕完美修复及皮肤组织的再生提供新的实验参考。 方法：采用免 疫组织化学的方法探寻胎儿皮肤中的表皮干细胞(epidermal stemcells，ESCs)， 研究不同发育时期 ESCs 在胎儿皮肤中分布与迁移。采用改良的型胶原铺板选 择黏附法分离培养人 ESCs，观察其形态及增值分化的特点，并进行细胞免疫组 织化学鉴定。同时，提取小鼠胚胎发育中期组织液，模拟表皮干细胞壁龛微环 境，采用免疫组织化学、免疫荧光染色、流式细胞检测及 RT-PCR 技术研究表皮 干细胞在此环境中的表型变化，探讨表皮干细胞周围生长微环境在表皮干细胞 “命运”决定过程中的作用。此外，本研究在前期的工作基础上，建立表皮细 胞去分化研究的体内、体外实验模型，采用免疫组织化学、MTT 法、免疫荧光 染色、流式细胞技术、扫描及透射电镜检测技术、RT-PCR、Western-blot 及 TRAP 法再次验证表皮细胞通过去分化途径形成机体内源性去分化来源的表皮干 细胞，参与皮肤组织的创伤修复与再生。同时，从细胞表型、超微结构及生物 学功能等方面比较去分化来源的表皮干细胞和机体自身来源的表皮干细胞二者 之间的异同点。 结果：表皮干细胞在从基底层经棘层和颗粒层到角质层的分 化迁移过程中，经历了有序的成熟模式，这一过程与角蛋白的程序性表达密切 相关；毛囊的发生、发育不仅与 ESCs 的增殖分化有关，同时受到毛乳头的诱导 作用。改良的型胶原选择黏附法能够高效的分离表皮中的干细胞。这些细胞 具有干细胞的形态特点表达 6 整合素，1 整合素， CK19，CK14，p63，Nestin 及 PCNA 为阳性，而 CK10 染色为阴性；激光共聚焦 检测显示 6 整合素和 CD71 在表皮干细胞中的分布存在着区域性差异，可以作 为区分标志之一，为 ESCs 及其亚群的分离与鉴定提供实验参考。此外，流式细 胞检测显示胚胎组织提取液作用后 6+CD71-表达细胞由细胞总数的 22.49减 少至 10.92，而 6+CD71+、6-CD71+表达细胞则分别由诱导前的 62.29 及 0.19增加至诱导后的 68.34及 4.51。RT-PCR 结果表明胚胎组织提取液 作用后，表皮干细胞中 1 整合素、CK19、CK10 表达增强，而 CK14 表达减弱。 本文在前期工作的基础上，建立了表皮细胞去分化研究的体内、体外实验模型， 免疫组织化学染色结果显示去基底层的超薄皮片 CK19 和 1 整合素染色为阴性； 而移植第 3、5、7d 后，存活皮片内 CK19 和 1 整合素染色阳性的细胞重新出 现，并且呈多层分布；流式细胞仪检测结果表明移植前后 6+CD71-和 6+CD71+细胞比例有明显差异。人细胞系 HEKa 体外培养 67 代时，开始出现 老化迹象。 细胞免疫组织化学检测结果显示此时细胞表达 CK10 为强阳性， 而 1 整合素、CK19 表达为阴性，CK14 则呈现弱阳性染色。在浓度为 100ng/ml 的 bFGF 诱导培养 3648h 后，老化的 HEKa 细胞之间开始出现新生的 表皮干细胞样克隆。这些细胞体积较小，为圆梭形，形态均一、折光性强、胞 质近中央处有圆形核，核浆比大，因此称之为去分化来源的表皮干细胞(dHEK 细胞)。dHEK 细胞不但具有克隆形成能力，而且具有强大的分裂增殖能力。随着培养的延长，dHEK 细胞克隆的面积逐渐增大，相互连接成片，并且和周围的 HEKa 细胞之间相互嵌合形成表皮嵴样结构。免疫组织化学检测发现 bFGF 诱导 培养后，实验组细胞中 1 整合素、CK19 和 CK14 的表达增强；CK10 作为终末 分化细胞的标志，在 bFGF 诱导组中的表达明显降低。流式细胞检测分析显示 bFGF 作用后，实验组 CK14 表达阳性的细胞与对照组相比明显增多(分别为 87.14和 67.26)。CK19 表达阳性的细胞也由原来的 15.74增加至被检测 细胞总数的 74.77。而 bFGF 诱导作用后，被检测细胞中表达 CK10 阳性的细 胞数量较对照组明显下降(分别为 4.56和 98.56)。此外，RT-PCR 和 Western-blot 检测结果同样再次支持了表皮细胞去分化的现象。在 bFGF 作用 后，表皮细胞重新程序化，并获得其前体干细胞的某些潜在能力，表达表皮干 细胞的一些未分化蛋白。另外，表皮干细胞和去分化来源的 dHEK 细胞之间有两 个显著的相同点：(1)二者都表达表皮干细胞的表面标志，如 1 整合素、6 整合素和 CK19 等；(2)二者都存在着 6 整合素和 CD71 表达的区域性分布差异。 此外，表皮干细胞和 dHEK 细胞之间的差异点有：(1)CD71-PE 和 6 integrin- FITC 直标双色荧光流式检测分析显示表皮干细胞和去分化来源的 dHEK 细胞之 间存在着细胞亚群的分布差异；(2)hTERT 在表皮干细胞和去分化而来的干细胞 中存在着业细胞定位差异。 结论：ESCs 并非真正静止的未分化细胞，而是 一种已经进入分化状态但是仍具有多向分化潜能的干细胞，其增殖分化行为不 但受到自身程序化基因表达的影响，同时又受到其所处的微环境的调控。bFGF 能够诱导表皮细胞在体外发生去分化，去分化而来的表皮干细胞与 ESCs 相比具 有更加强大的分裂增殖能力，可以作为种子细胞应用于皮肤创伤修复与再生的 相关研究之中。正文内容正文内容目的：从建立表皮细胞去分化模型入手，比较去分化来源的表皮干细胞和 机体自身来源的表皮干细胞在功能和生物学特性等方面的异同点，为实现无延 迟、无瘢痕完美修复及皮肤组织的再生提供新的实验参考。 方法：采用免疫 组织化学的方法探寻胎儿皮肤中的表皮干细胞(epidermal stemcells，ESCs)， 研究不同发育时期 ESCs 在胎儿皮肤中分布与迁移。采用改良的型胶原铺板选 择黏附法分离培养人 ESCs，观察其形态及增值分化的特点，并进行细胞免疫组 织化学鉴定。同时，提取小鼠胚胎发育中期组织液，模拟表皮干细胞壁龛微环 境，采用免疫组织化学、免疫荧光染色、流式细胞检测及 RT-PCR 技术研究表皮 干细胞在此环境中的表型变化，探讨表皮干细胞周围生长微环境在表皮干细胞 “命运”决定过程中的作用。此外，本研究在前期的工作基础上，建立表皮细 胞去分化研究的体内、体外实验模型，采用免疫组织化学、MTT 法、免疫荧光 染色、流式细胞技术、扫描及透射电镜检测技术、RT-PCR、Western-blot 及 TRAP 法再次验证表皮细胞通过去分化途径形成机体内源性去分化来源的表皮干 细胞，参与皮肤组织的创伤修复与再生。同时，从细胞表型、超微结构及生物 学功能等方面比较去分化来源的表皮干细胞和机体自身来源的表皮干细胞二者 之间的异同点。 结果：表皮干细胞在从基底层经棘层和颗粒层到角质层的分 化迁移过程中，经历了有序的成熟模式，这一过程与角蛋白的程序性表达密切 相关；毛囊的发生、发育不仅与 ESCs 的增殖分化有关，同时受到毛乳头的诱导 作用。改良的型胶原选择黏附法能够高效的分离表皮中的干细胞。这些细胞 具有干细胞的形态特点表达 6 整合素，1 整合素， CK19，CK14，p63，Nestin 及 PCNA 为阳性，而 CK10 染色为阴性；激光共聚焦 检测显示 6 整合素和 CD71 在表皮干细胞中的分布存在着区域性差异，可以作 为区分标志之一，为 ESCs 及其亚群的分离与鉴定提供实验参考。此外，流式细 胞检测显示胚胎组织提取液作用后 6+CD71-表达细胞由细胞总数的 22.49减 少至 10.92，而 6+CD71+、6-CD71+表达细胞则分别由诱导前的 62.29 及 0.19增加至诱导后的 68.34及 4.51。RT-PCR 结果表明胚胎组织提取液 作用后，表皮干细胞中 1 整合素、CK19、CK10 表达增强，而 CK14 表达减弱。 本文在前期工作的基础上，建立了表皮细胞去分化研究的体内、体外实验模型， 免疫组织化学染色结果显示去基底层的超薄皮片 CK19 和 1 整合素染色为阴性； 而移植第 3、5、7d 后，存活皮片内 CK19 和 1 整合素染色阳性的细胞重新出 现，并且呈多层分布；流式细胞仪检测结果表明移植前后 6+CD71-和 6+CD71+细胞比例有明显差异。人细胞系 HEKa 体外培养 67 代时，开始出现 老化迹象。 细胞免疫组织化学检测结果显示此时细胞表达 CK10 为强阳性， 而 1 整合素、CK19 表达为阴性，CK14 则呈现弱阳性染色。在浓度为 100ng/ml 的 bFGF 诱导培养 3648h 后，老化的 HEKa 细胞之间开始出现新生的 表皮干细胞样克隆。这些细胞体积较小，为圆梭形，形态均一、折光性强、胞 质近中央处有圆形核，核浆比大，因此称之为去分化来源的表皮干细胞(dHEK 细胞)。dHEK 细胞不但具有克隆形成能力，而且具有强大的分裂增殖能力。随 着培养的延长，dHEK 细胞克隆的面积逐渐增大，相互连接成片，并且和周围的 HEKa 细胞之间相互嵌合形成表皮嵴样结构。免疫组织化学检测发现 bFGF 诱导 培养后，实验组细胞中 1 整合素、CK19 和 CK14 的表达增强；CK10 作为终末 分化细胞的标志，在 bFGF 诱导组中的表达明显降低。流式细胞检测分析显示bFGF 作用后，实验组 CK14 表达阳性的细胞与对照组相比明显增多(分别为 87.14和 67.26)。CK19 表达阳性的细胞也由原来的 15.74增加至被检测 细胞总数的 74.77。而 bFGF 诱导作用后，被检测细胞中表达 CK10 阳性的细 胞数量较对照组明显下降(分别为 4.56和 98.56)。此外，RT-PCR 和 Western-blot 检测结果同样再次支持了表皮细胞去分化的现象。在 bFGF 作用 后，表皮细胞重新程序化，并获得其前体干细胞的某些潜在能力，表达表皮干 细胞的一些未分化蛋白。另外，表皮干细胞和去分化来源的 dHEK 细胞之间有两 个显著的相同点：(1)二者都表达表皮干细胞的表面标志，如 1 整合素、6 整合素和 CK19 等；(2)二者都存在着 6 整合素和 CD71 表达的区域性分布差异。 此外，表皮干细胞和 dHEK 细胞之间的差异点有：(1)CD71-PE 和 6 integrin- FITC 直标双色荧光流式检测分析显示表皮干细胞和去分化来源的 dHEK 细胞之 间存在着细胞亚群的分布差异；(2)hTERT 在表皮干细胞和去分化而来的干细胞 中存在着业细胞定位差异。 结论：ESCs 并非真正静止的未分化细胞，而是 一种已经进入分化状态但是仍具有多向分化潜能的干细胞，其增殖分化行为不 但受到自身程序化基因表达的影响，同时又受到其所处的微环境的调控。bFGF 能够诱导表皮细胞在体外发生去分化，去分化而来的表皮干细胞与 ESCs 相比具 有更加强大的分裂增殖能力，可以作为种子细胞应用于皮肤创伤修复与再生的 相关研究之中。 目的：从建立表皮细胞去分化模型入手，比较去分化来源的表皮干细胞和机体 自身来源的表皮干细胞在功能和生物学特性等方面的异同点，为实现无延迟、 无瘢痕完美修复及皮肤组织的再生提供新的实验参考。 方法：采用免疫组织 化学的方法探寻胎儿皮肤中的表皮干细胞(ep