海洋生物学专业毕业论文海洋生物学专业毕业论文 精品论文精品论文 单环刺螠纤溶酶分离纯化、单环刺螠纤溶酶分离纯化、免疫原性及其基因克隆的初步研究免疫原性及其基因克隆的初步研究关键词：血栓栓塞性疾病关键词：血栓栓塞性疾病 单环刺螠纤溶酶单环刺螠纤溶酶 酶分离纯化酶分离纯化 免疫原性免疫原性 基因克隆基因克隆 溶溶 栓剂栓剂摘要：本研究旨在从海洋动物单环刺螠(Urechis unicinctus)体内提取纯化出 一种新型的生物溶栓剂，在此基础上确定其分子特征、酶免疫原性，并克隆部 分编码区 cDNA，为进一步开展基因工程菌的构建，重组活性蛋白的表达的深入 研究奠定基础。 方法：将单环刺螠体腔液经离心，经分子量 8,000Da 和 30kD 截留分子量滤膜超滤、Sephadex G-75、DE52 阴离子交换层析柱和 Sephacryl S-100HR 凝胶柱分离等步骤进行酶的分离纯化。SDS-PAGE 电泳和 HPLC 鉴定纯度，测定其分子量。N 端测序及质谱从头测序(de novo)确定该酶的 部分氨基酸序列。 为研究单环刺螠纤溶酶作为一种潜在药物，其对药物安全 性评价的影响和动物体内过敏反应，对该纤溶酶进行了初步免疫原性研究，以 天然纤溶酶和加热变性纤溶酶分别免疫新西兰兔，采用背部皮下和后腿肌肉多 点注射进行免疫，琼脂双向扩散法测定纤溶酶抗体效价。 采用 RT-PCR 的方 法，根据 N 端及另外 3 段氨基酸序列设计 10 条简并引物，组成 18 种组合，以 单环刺螠消化道组织总 RNA 为模板，用 RT-PCR 的方法尝试克隆该种纤溶酶组分 的 cDNA 片段。 结果：通过酶的纯化最终获得一种纯酶组分，在 SDS-PAGE 电 泳图谱上显示一条蛋白区带，经 HPLC 鉴定呈现单一峰，说明为纯品。蛋白质分 子量测定为约 26.4kDa。酶纯化倍数为 10.2，回收率为 13.9，比活力达 421.9U/mg。 经专一性水解酶降解，N 端测序及质谱分析，获取酶分子中 5 段多肽链的氨基酸序列，分别为：N 端：ICGGSPADIT；中间部分序列： DMKR；RNRLPHACMPZR；ACVWYFVH；BNEGGYLDACM。经 Blastp 比对分析，没有发 现同源性较高的序列，说明此酶为一种新发现的蛋白酶。 琼脂双向扩散平板 未出现免疫沉淀线，表明该酶免疫原性低，在兔体内未产生可检测的抗体量。 结论：本实验中克隆得到了 3 个基因片段，经 Blastp 搜索分析，其中 2 个片段 与蚯蚓、白蚁等动物来源的内切葡聚糖酶相似性较高，1 个与 septin 基因家族 成员 septin11 相似性较高。但设计引物所依据的氨基酸序列是根据质谱图推算 出的，这种方法鉴定的可靠性有待进一步确定。可能需要再结合传统化学方法 进行末端氨基酸序列测定，再分离基因。数据库所给出的结果虽然显示了一定 的相似性，但尚不能确定获得的序列与搜索到的基因是同一类基因，也有可能 是一种全新的具有纤溶活力的蛋白质。要最终证明其是否为纤维蛋白溶解酶， 需要通过克隆全长 cDNA 序列，在原核或真核生物中表达，获得重组蛋白，测定 是否具有纤溶活力。正文内容正文内容本研究旨在从海洋动物单环刺螠(Urechis unicinctus)体内提取纯化出一 种新型的生物溶栓剂，在此基础上确定其分子特征、酶免疫原性，并克隆部分 编码区 cDNA，为进一步开展基因工程菌的构建，重组活性蛋白的表达的深入研 究奠定基础。 方法：将单环刺螠体腔液经离心，经分子量 8,000Da 和 30kD 截留分子量滤膜超滤、Sephadex G-75、DE52 阴离子交换层析柱和 Sephacryl S-100HR 凝胶柱分离等步骤进行酶的分离纯化。SDS-PAGE 电泳和 HPLC 鉴定纯度， 测定其分子量。N 端测序及质谱从头测序(de novo)确定该酶的部分氨基酸序列。为研究单环刺螠纤溶酶作为一种潜在药物，其对药物安全性评价的影响和动 物体内过敏反应，对该纤溶酶进行了初步免疫原性研究，以天然纤溶酶和加热 变性纤溶酶分别免疫新西兰兔，采用背部皮下和后腿肌肉多点注射进行免疫， 琼脂双向扩散法测定纤溶酶抗体效价。 采用 RT-PCR 的方法，根据 N 端及另 外 3 段氨基酸序列设计 10 条简并引物，组成 18 种组合，以单环刺螠消化道组 织总 RNA 为模板，用 RT-PCR 的方法尝试克隆该种纤溶酶组分的 cDNA 片段。 结果：通过酶的纯化最终获得一种纯酶组分，在 SDS-PAGE 电泳图谱上显示一条 蛋白区带，经 HPLC 鉴定呈现单一峰，说明为纯品。蛋白质分子量测定为约 26.4kDa。酶纯化倍数为 10.2，回收率为 13.9，比活力达 421.9U/mg。 经 专一性水解酶降解，N 端测序及质谱分析，获取酶分子中 5 段多肽链的氨基酸 序列，分别为：N 端：ICGGSPADIT；中间部分序列： DMKR；RNRLPHACMPZR；ACVWYFVH；BNEGGYLDACM。经 Blastp 比对分析，没有发 现同源性较高的序列，说明此酶为一种新发现的蛋白酶。 琼脂双向扩散平板 未出现免疫沉淀线，表明该酶免疫原性低，在兔体内未产生可检测的抗体量。 结论：本实验中克隆得到了 3 个基因片段，经 Blastp 搜索分析，其中 2 个片段 与蚯蚓、白蚁等动物来源的内切葡聚糖酶相似性较高，1 个与 septin 基因家族 成员 septin11 相似性较高。但设计引物所依据的氨基酸序列是根据质谱图推算 出的，这种方法鉴定的可靠性有待进一步确定。可能需要再结合传统化学方法 进行末端氨基酸序列测定，再分离基因。数据库所给出的结果虽然显示了一定 的相似性，但尚不能确定获得的序列与搜索到的基因是同一类基因，也有可能 是一种全新的具有纤溶活力的蛋白质。要最终证明其是否为纤维蛋白溶解酶， 需要通过克隆全长 cDNA 序列，在原核或真核生物中表达，获得重组蛋白，测定 是否具有纤溶活力。 本研究旨在从海洋动物单环刺螠(Urechis unicinctus)体内提取纯化出一种新 型的生物溶栓剂，在此基础上确定其分子特征、酶免疫原性，并克隆部分编码 区 cDNA，为进一步开展基因工程菌的构建，重组活性蛋白的表达的深入研究奠 定基础。 方法：将单环刺螠体腔液经离心，经分子量 8,000Da 和 30kD 截留 分子量滤膜超滤、Sephadex G-75、DE52 阴离子交换层析柱和 Sephacryl S- 100HR 凝胶柱分离等步骤进行酶的分离纯化。SDS-PAGE 电泳和 HPLC 鉴定纯度， 测定其分子量。N 端测序及质谱从头测序(de novo)确定该酶的部分氨基酸序列。为研究单环刺螠纤溶酶作为一种潜在药物，其对药物安全性评价的影响和动 物体内过敏反应，对该纤溶酶进行了初步免疫原性研究，以天然纤溶酶和加热 变性纤溶酶分别免疫新西兰兔，采用背部皮下和后腿肌肉多点注射进行免疫， 琼脂双向扩散法测定纤溶酶抗体效价。 采用 RT-PCR 的方法，根据 N 端及另 外 3 段氨基酸序列设计 10 条简并引物，组成 18 种组合，以单环刺螠消化道组织总 RNA 为模板，用 RT-PCR 的方法尝试克隆该种纤溶酶组分的 cDNA 片段。 结果：通过酶的纯化最终获得一种纯酶组分，在 SDS-PAGE 电泳图谱上显示一条 蛋白区带，经 HPLC 鉴定呈现单一峰，说明为纯品。蛋白质分子量测定为约 26.4kDa。酶纯化倍数为 10.2，回收率为 13.9，比活力达 421.9U/mg。 经 专一性水解酶降解，N 端测序及质谱分析，获取酶分子中 5 段多肽链的氨基酸 序列，分别为：N 端：ICGGSPADIT；中间部分序列： DMKR；RNRLPHACMPZR；ACVWYFVH；BNEGGYLDACM。经 Blastp 比对分析，没有发 现同源性较高的序列，说明此酶为一种新发现的蛋白酶。 琼脂双向扩散平板 未出现免疫沉淀线，表明该酶免疫原性低，在兔体内未产生可检测的抗体量。 结论：本实验中克隆得到了 3 个基因片段，经 Blastp 搜索分析，其中 2 个片段 与蚯蚓、白蚁等动物来源的内切葡聚糖酶相似性较高，1 个与 septin 基因家族 成员 septin11 相似性较高。但设计引物所依据的氨基酸序列是根据质谱图推算 出的，这种方法鉴定的可靠性有待进一步确定。可能需要再结合传统化学方法 进行末端氨基酸序列测定，再分离基因。数据库所给出的结果虽然显示了一定 的相似性，但尚不能确定获得的序列与搜索到的基因是同一类基因，也有可能 是一种全新的具有纤溶活力的蛋白质。要最终证明其是否为纤维蛋白溶解酶， 需要通过克隆全长 cDNA 序列，在原核或真核生物中表达，获得重组蛋白，测定 是否具有纤溶活力。 本研究旨在从海洋动物单环刺螠(Urechis unicinctus)体内提取纯化出一种新 型的生物溶栓剂，在此基础上确定其分子特征、酶免疫原性，并克隆部分编码 区 cDNA，为进一步开展基因工程菌的构建，重组活性蛋白的表达的深入研究奠 定基础。 方法：将单环刺螠体腔液经离心，经分子量 8,000Da 和 30kD 截留 分子量滤膜超滤、Sephadex G-75、DE52 阴离子交换层析柱和 Sephacryl S- 100HR 凝胶柱分离等步骤进行酶的分离纯化。SDS-PAGE 电泳和 HPLC 鉴定纯度， 测定其分子量。N 端测序及质谱从头测序(de novo)确定该酶的部分氨基酸序列。为研究单环刺螠纤溶酶作为一种潜在药物，其对药物安全性评价的影响和动 物体内过敏反应，对该纤溶酶进行了初步免疫原性研究，以天然纤溶酶和加热 变性纤溶酶分别免疫新西兰兔，采用背部皮下和后腿肌肉多点注射进行免疫， 琼脂双向扩散法测定纤溶酶抗体效价。 采用 RT-PCR 的方法，根据 N 端及另 外 3 段氨基酸序列设计 10 条简并引物，组成 18 种组合，以单环刺螠消化道组 织总 RNA 为模板，用 RT-PCR 的方法尝试克隆该种纤溶酶组分的 cDNA 片段。 结果：通过酶的纯化最终获得一种纯酶组分，在 SDS-PAGE 电泳图谱上显示一条 蛋白区带，经 HPLC 鉴定呈现单一峰，说明为纯品。蛋白质分子量测定为约 26.4kDa。酶纯化倍数为 10.2，回收率为 13.9，比活力达 421.9U/mg。 经 专一性水解酶降解，N 端测序及质谱分析，获取酶分子中 5 段多肽链的氨基酸 序列，分别为：N 端：ICGGSPADIT；中间部分序列： DMKR；RNRLPHACMPZR；ACVWYFVH；BNEGGYLDACM。经 Blastp 比对分析，没有发 现同源性较高的序列，说明此酶为一种新发现的蛋白酶。 琼脂双向扩散平板 未出现免疫沉淀线，表明该酶免疫原性低，在兔体内未产生可检测的抗体量。 结论：本实验中克隆得到了 3 个基因片段，经 Blastp 搜索分析，其中 2 个片段 与蚯蚓、白蚁等动物来源的内切葡聚糖酶相似性较高，1 个与 septin 基因家族 成员 septin11 相似性较高。但设计引物所依据的氨基酸序列是根据质谱图推算 出的，这种方法鉴定的可靠性有待进一步确定。可能需要再结合传统化学方法 进行末端氨基酸序列测定，再分离基因。数据库所给出的结果虽然显示了一定的相似性，但尚不能确定获得的序列与搜索到的基因是同一类基因，也有可能 是一种全新的具有纤溶活力的蛋白质。要最终证明其是否为纤维蛋白溶解酶， 需要通过克隆全长 cDNA 序列，在原核或真核生物中表达，获得重组蛋白，测定 是否具有纤溶活力。 本研究旨在从海洋动物单环刺螠(Urechis unicinctus)体内提取纯化出一种新 型的生物溶栓剂，在此基础上确定其分子特征、酶免疫原性，并克隆部分编码 区 cDNA，为