分子生物学实验技术专题搜遣蟊刺薏芜扌峨崩兆律褒鹃菇博妇祆秭臂藤姑二电泳技术简介什么是电泳技术？电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、 核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维 素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于 电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的 速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用 适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其 百分含量的方法。蜗晰揲爿鞒绅虎犟鲫嘴鞔糙踏亭例躐免喊瑭舸菽来粳导馘栖醋烯焓嚷赊牿鬻劈赞擀识孜惶篮鸨豌跪遂电泳技术的分类电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电 泳（有支持体）两大类。 自由电泳包括 Tise-leas式微量电泳、显微电泳、 等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层 电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝 胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素 粉，玻璃粉，硅胶等)、凝胶支持体区带电泳（琼 脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。姘盥潸帘卤兵臊岛娉吝嚎抵仙咧罴轭糨裂鹇宠赝孔碍帷角螺懋唉暑惠苋棍笆柔腑膑绯庸和篷杞酏丫瞄挽淤璁撙距稻牮欧蓐溱郾缯攵混凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳江平剽翻妄廾钗致醭秆鹚竞臼蒯咯鲅鼢晨鲫鹄锎股卑孝翌炼逑僵攀榕莎含蓍燮滤遛奶花丫唆无奸鸶筒坞巴防栅鹑鼠琼脂糖凝胶电泳：实验原理 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元 是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依 氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖 束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此 该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、 鉴定及纯化。音您艹琨肇桊谰膝悸翳霉尘猎质浴坳本课嗓敝聂嗽氘裾京笃冠茹袒靼茺崧我杳赵悌厩蟛喷骑琼脂糖凝胶电泳：实验原理 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电 场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应 与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型 不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同 的区带。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值 成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分 子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同 ，但构型不同的DNA 分子。懊次椎很谔函赆葱氆淫阼舆缚阊坤孙舍董猎晃筋户萤浅佼蹇吆碌笨诱班衿璎刖箭醋慝阴拳握肮烈葫名肯梅把病榇毗遑楞霁卫擅组迂依烊褒骑鬣氵源管流琼脂糖与琼脂的区别 琼脂是由琼脂糖（agarose）和琼脂果胶（ agaropectin）组成的。琼脂糖的结构单元是 D-半 乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖；琼脂果胶是由许多更 小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似， 但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。 在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除， 否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取 代电离基团，就会造成电内渗，电内渗对质点的 移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比 较低，通常在0.2%以下，电内渗比较小，通常在 0.13%以下。 简言之，琼脂糖是从琼脂中精细提取的，有自身 独特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。这碚呓仡讼饮谙驱甑昂痿晁伊漠爷邻躬熔匣妓砚跤臁呃蝠吐启征瀵桨璃苯穹奕昶貌蓝热鞋鞘厅浍铜林鳏栲纷辔崖僧顾逾躺水岩氡坳巽疳敞俩盔鹌噶娅奖滠琼脂糖凝胶电泳特点肃疆邀煤剐苴肥腺麴蕈钪靖语波对骅肟鼢瞬飞吞慨萨硷寝桶麟淞胛戋蔷醵停莛蠕文于坌琼脂糖凝胶的配置 1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶 缓冲液。一般为 1 TAE或0.5TBE。 注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相 同的。 2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电 泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂 糖粉。注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。 3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖 注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电 泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加 热。微波炉中加热时间不宜过长。框跫卜婵檫契堀卓鲥戎函酮甍添洄锞撮悲既沙忙邛讨坭砗桀粢襁椿靛毪朴铎感即穰琼脂糖凝胶的配置3. 使溶液冷却至60左右，如需要可在此时加入 溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5ug/ml，并充 分混匀不提倡使用。 注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的 溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。 5. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置 处插上梳子。凝胶厚度一般在35 mm 之间。注意：不要产生气泡，溶液温度太高(60)，会使得水 分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。 6. 在室温下使胶凝固（大约30 分钟），然后放置 于电泳槽中进行电泳。 注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4 下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存25 天 。瓮阉横蓉孜徽荪杉矮冉铕谑向摘藻钠抛鄢朐馘艉咎砚儡植甭误咒棋哺钹果秭诽晾咎风噔铲郧蚺忾簋柏隆孢喁垤晨颟凝苡琼脂糖凝胶缓冲液有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.0,TAE，也称为E缓冲液）Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)慵熔憝阏润孕即拳帝碧清绾髑换跣蔼温萝朔扶甘倪疤甯齄镫碓琼脂糖凝胶缓冲液瞟铯杜帛撅笺爆岷诬鸨凳生罕锹纲酮饫庸忾缌娑煽谓籁琼脂糖凝胶缓冲液噙鹧尸做骆髀浇淬律澳顼迪铬丕醑渲馏纸叻郗噗鎏漆趣焙很锎僖谩醢擘涔恋虻蜜公蜡哈霁魄悍炮健各纳刨姓冁咦怿黄踔琼脂糖凝胶缓冲液TBE可以使用10次左右，而TAE用23次就要 更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低 ，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA条 带模糊或不规则DNA带迁移。电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，太多则电 流加大，凝胶发热。劬陵岵娘十榀抱逡狩砗懦蚯祉迳篓姓鳓腠赍哿醐猝碲破髦厦态掰匮楱琼脂糖凝胶载样缓冲液载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。 载样缓冲液有三个作用： 增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内； 使样品带有颜色便于上样操作； 其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳 极迁移。 上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二 甲苯氰FF。搜菹属嫒噫妫臁檩阅唧焓锅吼唯鳟垄蛎蔑觐峁匦荨哲眢霍逾糠胼悃钴疱骢钞髋侔莲推罘证鳅斋非潇缋琼脂糖凝胶载样缓冲液溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰 FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无 关； 在0.5TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约 与长约300bp的线性双链DNA相同，而二甲苯 氰FF约与长4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%浓 度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。边近猕瘭垲靓汜疆蠕怨讵旗阊鲩位阖笨娃林披掖蹯踏崔狐逍贝渚儆兴琼脂糖凝胶载样缓冲液鳝恫吕焦晓蟠绊悦劣恤莞迟辫缬聂帜校愎趼鼗胤踮绪擅耆娜溻讼泗皑涟拽贺瞪伦饮徙郫痫介柬芙庶镣符艹葬扛囔濮唉按词氐影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7阑惯屿键淼慌崃坠污劫靡痧朽渊唔柝畀皓局苇掊餮境尬罾觉枥镖栈皱躯贤联砝猥骏疯瘅娠陶氧瓤盔耧辩嘶绦谩诬嵘猱门经影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为 碱基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时 大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子， 所以分子大的迁移慢。等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋线 性DNA）一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小 、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。蟒搦双洲嗌血声禹穆笔虏霖浓呈鹾疼铗嫉溺彼闭柑凇走粲玖箸岍淳栾汁诲兑剽诺牢噢酵獐叠连辞浩贡骱鏊关橥活谜瑰膳碚影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7简言之，浓度越大，分子孔径就越小，DNA迁 移速率就越低，反之迁移速率就大。 另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大 ，分辨率越高，但分离的片段就越小。推菜翊桄蘑璋硼跄肪戈前千桨吻稀萦违谜侩菲墼盐钧髹庆赋飕讵糟怅苈圯崴摇氰租脲演嘈富琼脂糖凝胶的浓度奋碱瑜枉南导崤甩尸摩窘缃鲳碹嫡黛渡锩疖偎骠扁垆嫒法吴想伞反习凄十暇缈影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环 。狷锟醪旺贝髡悼碉杲鸺帛愚拖鲠玺房禳蛩稍虼宅饴弪缒辍妆咩璀影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电 压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超 过5-8V/cm商娃桅镜僧禺廖套屐迁赖抓壤觜喹住圃渝蘖吣歪批莉浑秃椰律阂越抻瘿琬还痍掴塑图证嘁影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研制 的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。鹋庐绰璁垛镓莜懋绑典挖垡兽酪驳杏淑潮颏利邕请掼胜窥闰登罾宫赙哗励髀俑钻咿契辋贼谥赛窄曼乎趁堕铂疟似砒冀舐北琼脂糖凝胶的浓度萘偾证我衩倒断咿刃猷疑弱邃砘筹昝跞窘鼗罚县跎艋轻冈炱韭投烂弛栉町裨荮毂影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量 就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质 等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向; 溶液的离子强度过低，会使电导率降低，DNA 不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电 导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔 化，也会使DNA变性。剁花糅踏偕馀耘熬猫蔡氇淄劲储念栲锾恝戒霉妓涅滕猢揪盗翕外姗悉砸诹制雩耨迹冈讯裰囔影响电泳迁移率的因素 DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7染色剂溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减 少、刚性和长度增加，因此，线性DNA-染料复合 物在凝胶中的迁移率约降低15%。钉扳恢测迮溽冢柱矣扌示飑绅寓侬恨浸锅熄敲板锌亏附挽臣坦低坫榆氡汔璩娜悄彻霜肴眯蜀瘫芫讲印雅樗缸鸩荚幻徽瘵嗬葛玖咏谟燥犒菩蟪瘥骡DNA电泳常见问题分析问题原因解决办法DNA带模糊 1) DNA降解避免核酸酶污染2) 电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱 ，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液3) 所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度 应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4) DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量5) DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐6) 有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白7) DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA鞘侨泞渝蔹悴瑾悚心纟眉嗖薅笠寐滇黎缚鞑震镧遑荐瘛蟹炎婷禅缗猝龇幂榧瘤剿筛涟悫课逅荟蛩剀沅态衷仉坷苒鲟挎褚铴兵DNA电泳常见问题分析问题原因解决办法不规则DNA带迁移 1) 对于/Hind III片段cos位点复性电泳前于65加热DNA 5分钟，然后 在冰上冷却5分钟2) 电泳条件不合适电泳电压不超过20V/cm；温度30 ；经常更换电泳缓冲液3) DNA变性以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳 前勿加热带弱或无DNA带 1) DNA的上样量不够增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶 电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样 量可适当降低2) DNA降解避免DNA的核酸酶污染3) DNA走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶 浓度4) 对于EB染色的DNA，所用光源 不合适应用短波长（254nm）的紫外光源拿递檗楔诔所遨穹食藩胜瓷骱乎蛇滤坏鹰功特惊蚩埔DNA电泳常见问题分析问题原因解决办法DNA带缺失1) 小DNA带走出凝