基础医学基础医学( (免疫学免疫学) )专业毕业论文专业毕业论文 精品论文精品论文 肝癌细胞肝癌细胞 RIG-IRIG-I 信信号通路在肝癌免疫治疗中的意义与相关机制研究号通路在肝癌免疫治疗中的意义与相关机制研究关键词：肝癌细胞关键词：肝癌细胞 RIG-IRIG-I 信号通路信号通路 肝癌免疫肝癌免疫 维甲酸诱导基因维甲酸诱导基因 干扰素干扰素摘要：肝细胞癌(Hepatocellular caicinoma，HCC)位居世界癌症死亡率的第三 位，也是我国最常见的肿瘤之一，占我国肿瘤死因的第 2 位。研究表明 HBV、HCV 引起的慢性感染与肝癌的发生发展密切相关。目前对于肝癌发生发展 分子机制的研究仍然不甚了解，特别是对于肝癌如何逃逸免疫监视而发生以及 如何诱导免疫功能失能并导致机体免疫功能抑制，使得肝癌得以生长与转移的 细胞与分子机制有待于进一步深入研究。 机体通过模式识别受体(Pattern- recognition receptors，PRRs)识别病毒核酸，产生抗病毒天然免疫应答。维 甲酸诱导基因(Retinoic-acid-inducible gene，RIG-)作为机体识别病 毒的主要免疫识别受体属于维甲酸诱导基因样受体家族(Retinoic-acid- inducible gene(RIG-)-lke receptors，RLRs)的主要成员，在机体的抗病 毒免疫应答特别是型干扰素的诱导产生中发挥着重要作用，此外，与细胞的 生长调控也有一定的关系，是近年来免疫学基础研究的前沿热点之一。然而， RIG-与肿瘤的发生发展之间有无联系?RIG-的表达与肿瘤之间的相互关系如 何?目前仍不是十分清楚。 本研究探讨了 RIG-与肝癌之间的相互关系及其 对肝癌免疫治疗的影响。 一、肝癌组织中 RIG-表达降低的研究 为了探 讨 RIG-与肝癌之间的相互关系，我们首先利用肝癌标本组织芯片，通过免疫 组化的方法检测了肝癌组织及对应的癌旁组织中 RIG-蛋白的表达情况。结果 发现，在 30 例原发性肝癌患者中，27 例患者的癌旁组织中 RIG-蛋白表达为 阳性，阳性率为 90。然而，在 30 例肝癌患者的肝癌组织中，只有 5 例患者 的癌组织中 RIG-蛋白表达为阳性，1 例患者的癌组织中 RIG-蛋白表达为弱 阳性，阳性率为 20。该结果提示 RIG-蛋白在肝癌组织中的表达显著降低。 之后，我们又对肝癌患者癌组织与癌旁组织中 RIG-表达的改变进行了分析。 结果表明，癌组织比癌旁组织 RIG-蛋白表达明显降低的病例占 73，无明显 变化的病例占 27。我们随机挑选了其中 3 例病例，免疫组化结果显示癌旁组 织中可见清晰的肝索组织，细胞核清晰、较均一，呈苏木素深染，胞核周围的 胞浆中可见 RIG-蛋白 DAB 染色呈阳性。然而，肝癌组织结构杂乱，细胞呈巢 团状、腺样及弥散状排列，细胞立方形或胞界不清，核大异型明显，呈苏木素 深染，胞核周围 RIG-蛋白 DAB 染色呈弱阳性或阴性改变。 上述肝癌组织 芯片免疫组化检测结果提示，在肝癌患者的癌旁组织中 RIG-蛋白广泛表达， 且主要在核周胞质中分布，然而，在肝癌组织中 RIG-蛋白表达明显下调。 那么，除了肝癌组织，在其他肿瘤中 RIG-蛋白表达的情况如何呢?我们利用 人类多器官肿瘤组织芯片和人类生殖系统肿瘤组织芯片通过免疫组化检测 RIG- 蛋白的表达情况，发现在前列腺腺癌、肾透明细胞癌、子宫内膜癌和食道癌 组织中，同样也存在 RIG-蛋白表达下调的现象。 为了进一步确证上述结 果，我们利用肝癌新鲜临床组织标本，通过提取组织总 RNA 和总蛋白，利用实 时荧光定量 PCR 和 Western blot 分别检测了 RIG-的基因和蛋白水平表达。 结果发现，与正常肝组织和癌旁组织相比，肝癌组织中的 RIG-表达显著降低。 可见，肝癌以及多种肿瘤组织中 RIG-表达显著降低。 二、碱性 FGF 抑制肝癌细胞 RIG-表达及其相关机制的研究 是什么原因导致了肝癌组织中 RIG-的表达显著下调呢?以往研究表明维甲酸(Acyclic retinoid，ACR)能够 通过抑制碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor，bFGF)信 号通路抑制肝癌细胞生长。而 RIG-又是维甲酸诱导表达的基因，同时，又有 报道肝癌组织高表达 bFGF。因此，我们推测是否是肿瘤组织内高表达的 bFGF 导致了 RIG-的表达下调。首先，我们用不同浓度的人重组碱性成纤维细胞生 长因子(bFGF)刺激人肝癌细胞株 SMMC-7721、HepG2、Hep3B 和人张氏肝细胞 Changliver，24 小时后实时荧光定量 PCR 检测 RIG-基因的表达。结果发现， SMMC-7721 细胞对于 bFGF 的刺激较为敏感，并且 bFGF 对 RIG-基因的表达调 控较为一致，能显著降低 RIG-基因的表达，其中 100ng/ml bFGF 对 RIG-基 因表达的抑制作用最为显著。 由于 FGF 的信号传导主要通过其细胞表面受体 所介导。因此，我们接下来通过实时荧光定量 PCR 检测了上述人肝癌细胞株和 人张氏肝细胞中 FGF 不同受体(FGFreceptor，FGFR)的表达情况。结果发现 SMMC-7721 细胞高表达 FGFR1 和 FGFR3。 那么，在临床肝癌组织标本中 bFGF 及其相关受体的表达又如何昵?我们通过提取肝癌新鲜临床组织标本总 RNA，实 时荧光定量 PCR 检测，发现癌组织中的 RIG-表达显著降低，而 bFGF 和 FGFR1、FGFR3 表达显著升高。 为了进一步探讨 bFGF 对于 RIG-表达的抑制 作用，我们选择了对 bFGF 较敏感的 SMMC-7721 细胞作为细胞模型，用 100ng/ml 的 bFGF 刺激 SSMC-7721 细胞，实时荧光定量 PCR 在不同时间点 8 小 时、12 小时、16 小时和 24 小时分别检测 RIG-基因的表达。结果发现 bFGF 对 RIG-基因表达的抑制具有时间依赖性，24 小时的抑制作用最为显著。 PI3K(Phosphoinositide3-kinase/protein kinaseB，PI3K/Akt)和 ERK(Extracellularsilmal-regulated protein kinase)通路是 bFGF 下游两条 重要的信号通路。我们将这两条信号通路特异性的抑制剂 LY294002、U0126 以 及 FGF 受体特异性的抑制剂 PD173034 预处理 SMMC-7721 细胞 1 小时，实时荧光 定量 PCR 和 Western blot 检测结果发现其均能够有效地阻断 bFGF 刺激对 RIG- 基因和蛋白表达的抑制作用，表明 FGF 通过激活 PI3K 和 ERK 信号通路抑制了 肝癌细胞 RIG-的表达。 三、增强肝癌细胞对干扰素免疫治疗敏感性的研 究 干扰素(Interferon，IFN)作为一种病毒抑制因子，不仅具有抗病毒作用， 而且还具有免疫调节、抑制细胞增殖以及诱导细胞分化等作用。目前，人重组 的干扰素 (Recombinant human IFN-rhIFN-)已广泛应用于临床抗病毒 和抗肿瘤治疗，包括应用于肝癌的临床治疗。RIG-信号通路的活化能够促进 干扰素的产生，而干扰素又能够进一步的促进 RIG-的表达，从而形成一个正 反馈过程。那么，RIG-过表达对肝癌细胞干扰素 的免疫治疗有何影响呢? 首先，我们选择 500IU/ml、1000IU/m 和 2000IU/ml 的人重组干扰素 (rhIFN- )刺激 SMMC-7721 细胞，通过 MTT 检测 SMMC-7721 细胞增殖情况。结果发现不 同剂量的 rhIFN- 对细胞生长的体外抑制作用无显著差异，提示 SMMC-7721 细 胞对 rhIFN- 的刺激不敏感。 接着，我们将人全长 RIG-真核表达质粒转 染 SMMC-7721 细胞，转染后 24 小时加入 2000IU/ml rhIFN- 刺激，MTT 检测 细胞的增殖情况。结果发现 RIG-过表达能够明显增强 rhGIFN- 抑制肝癌细 胞的增殖。 那么，这种抑制增殖的作用是如何产生的呢?我们将人全长 RIG- 真核表达质粒转染 SMMC-7721 细胞，转染后 24 小时加入 2000IU/ml rhIFN- 刺激，24 小时后流式细胞仪检测结果发现 RIG-过表达后 rhIFN- 刺激能 够使肝癌细胞 G2/M 期的细胞数明显增加，提示促进了细胞周期 G2/M 期的阻滞。同时应用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，发现 RIG-过表达后 rhIFN- 刺 激能够促进肝癌细胞的凋亡。 综上所述，我们的结果提示在肝癌细胞中 bFGF 通过 FGFR1 和 FGFR3 活化 PI3K 和 ERK 信号通路，抑制 RIG-的表达。人 肝癌细胞株 SMMC-7721 过表达 RIG-后，能够显著增强 rhIFN- 对细胞增殖 的抑制作用，分析表明其增强了 rhIFN- 诱导的肝癌细胞 G2/M 期的周期阻滞 和促进肝癌细胞的凋亡，从而增强肝癌细胞对 rhIFN- 的敏感性。该结果为肝 癌免疫逃逸机制研究以及未来肝癌的免疫治疗提出了新的方向。正文内容正文内容肝细胞癌(Hepatocellular caicinoma，HCC)位居世界癌症死亡率的第三位， 也是我国最常见的肿瘤之一，占我国肿瘤死因的第 2 位。研究表明 HBV、HCV 引 起的慢性感染与肝癌的发生发展密切相关。目前对于肝癌发生发展分子机制的 研究仍然不甚了解，特别是对于肝癌如何逃逸免疫监视而发生以及如何诱导免 疫功能失能并导致机体免疫功能抑制，使得肝癌得以生长与转移的细胞与分子 机制有待于进一步深入研究。 机体通过模式识别受体(Pattern-recognition receptors，PRRs)识别病毒核酸，产生抗病毒天然免疫应答。维甲酸诱导基因 (Retinoic-acid-inducible gene，RIG-)作为机体识别病毒的主要免疫 识别受体属于维甲酸诱导基因样受体家族(Retinoic-acid-inducible gene(RIG-)-lke receptors，RLRs)的主要成员，在机体的抗病毒免疫应答 特别是型干扰素的诱导产生中发挥着重要作用，此外，与细胞的生长调控也 有一定的关系，是近年来免疫学基础研究的前沿热点之一。然而，RIG-与肿 瘤的发生发展之间有无联系?RIG-的表达与肿瘤之间的相互关系如何?目前仍 不是十分清楚。 本研究探讨了 RIG-与肝癌之间的相互关系及其对肝癌免 疫治疗的影响。 一、肝癌组织中 RIG-表达降低的研究 为了探讨 RIG- 与肝癌之间的相互关系，我们首先利用肝癌标本组织芯片，通过免疫组化的方 法检测了肝癌组织及对应的癌旁组织中 RIG-蛋白的表达情况。结果发现，在 30 例原发性肝癌患者中，27 例患者的癌旁组织中 RIG-蛋白表达为阳性，阳 性率为 90。然而，在 30 例肝癌患者的肝癌组织中，只有 5 例患者的癌组织 中 RIG-蛋白表达为阳性，1 例患者的癌组织中 RIG-蛋白表达为弱阳性，阳 性率为 20。该结果提示 RIG-蛋白在肝癌组织中的表达显著降低。 之后， 我们又对肝癌患者癌组织与癌旁组织中 RIG-表达的改变进行了分析。结果表 明，癌组织比癌旁组织 RIG-蛋白表达明显降低的病例占 73，无明显变化的 病例占 27。我们随机挑选了其中 3 例病例，免疫组化结果显示