基础兽医学专业毕业论文基础兽医学专业毕业论文 精品论文精品论文 大肠杆菌多重耐药调控基大肠杆菌多重耐药调控基因因 robrob 的克隆与表达的克隆与表达关键词：大肠杆菌关键词：大肠杆菌 多重耐药多重耐药 基因克隆基因克隆 巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母摘要：抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用，但是随着抗 生素的不恰当使用，由耐药菌株引起的人及动物感染性疾病不断增加，大肠杆 菌耐药及多重耐药现象已十分严重。主动外排系统可引起细菌对多种抗生素高 频率、高水平耐药。在大肠杆菌中发现存在 AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE 等主动外排系统，其中 AcrAB-TolC 外排泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统。 AcrAB-TolC 包括药物质子转运子 AcrB、间质融合蛋白 AcrA 和外膜通道蛋白 TolC。AcrAB 的表达水平受多种调控因子的调节，如 acrR. marA、mppA、sdiA、rob 和 soxS 等，其中，rob 是其中的一个正向调控因子。 选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌 5 株及大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922，分别以其染色体 DNA 为模板，通过 PCR 反应扩增出大肠杆菌多重耐 药调控基因 rob 片段，将上述基因片段分别与克隆载体 pMD18-T simple Vector 连接，连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态细胞中，对经酶切与 PCR 反应鉴定为阳性的克隆质粒进行插入片段的核苷酸序列测定。测序结果表明： 不同动物源性大肠杆菌的 rob 基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与 GeneBank 中该基因序列的同源性较高，核苷酸序列同源性在 98.799.9， 氨基酸同源性在 98.6100.0。rob 基因突变位点是否影响了 rob 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待进一步研究。将重组质粒 pMD18-T-rob 和 pPICZA 分别用 Kpn和 Xba酶切后构建成表 达质粒 pPICZA-rob，构建后的重组质粒电转化进 GS115 酵母感受态细胞中， 阳性重组子甲醇诱导、目的基因酵母表达条件的优化(甲醇浓度、诱导时间、诱 导起始 OD600 值等)以及发酵上清浓缩液的 SDS-PAGE 电泳分析结果表明大肠杆 菌多重耐药调控基因 rob 在毕赤酵母中能够表达，表达的目的蛋白的分子量约 为 33 kDa，与预测的分子量大小相符。 本试验获得的临床分离大肠杆菌多 重耐药调控基因 rob 的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其 AcrAB-TolC 外输泵的调控机制提供参考；获得的 rob 基因表达蛋白，将为进一 步制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离 动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。正文内容正文内容抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用，但是随着抗生 素的不恰当使用，由耐药菌株引起的人及动物感染性疾病不断增加，大肠杆菌 耐药及多重耐药现象已十分严重。主动外排系统可引起细菌对多种抗生素高频 率、高水平耐药。在大肠杆菌中发现存在 AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE 等 主动外排系统，其中 AcrAB-TolC 外排泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统。 AcrAB-TolC 包括药物质子转运子 AcrB、间质融合蛋白 AcrA 和外膜通道蛋白 TolC。AcrAB 的表达水平受多种调控因子的调节，如 acrR. marA、mppA、sdiA、rob 和 soxS 等，其中，rob 是其中的一个正向调控因子。 选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌 5 株及大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922，分别以其染色体 DNA 为模板，通过 PCR 反应扩增出大肠杆菌多重耐 药调控基因 rob 片段，将上述基因片段分别与克隆载体 pMD18-T simple Vector 连接，连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态细胞中，对经酶切与 PCR 反应鉴定为阳性的克隆质粒进行插入片段的核苷酸序列测定。测序结果表明： 不同动物源性大肠杆菌的 rob 基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与 GeneBank 中该基因序列的同源性较高，核苷酸序列同源性在 98.799.9， 氨基酸同源性在 98.6100.0。rob 基因突变位点是否影响了 rob 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待进一步研究。将重组质粒 pMD18-T-rob 和 pPICZA 分别用 Kpn和 Xba酶切后构建成表 达质粒 pPICZA-rob，构建后的重组质粒电转化进 GS115 酵母感受态细胞中， 阳性重组子甲醇诱导、目的基因酵母表达条件的优化(甲醇浓度、诱导时间、诱 导起始 OD600 值等)以及发酵上清浓缩液的 SDS-PAGE 电泳分析结果表明大肠杆 菌多重耐药调控基因 rob 在毕赤酵母中能够表达，表达的目的蛋白的分子量约 为 33 kDa，与预测的分子量大小相符。 本试验获得的临床分离大肠杆菌多 重耐药调控基因 rob 的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其 AcrAB-TolC 外输泵的调控机制提供参考；获得的 rob 基因表达蛋白，将为进一 步制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离 动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。 抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用，但是随着抗生素的 不恰当使用，由耐药菌株引起的人及动物感染性疾病不断增加，大肠杆菌耐药 及多重耐药现象已十分严重。主动外排系统可引起细菌对多种抗生素高频率、 高水平耐药。在大肠杆菌中发现存在 AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE 等主动 外排系统，其中 AcrAB-TolC 外排泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统。AcrAB- TolC 包括药物质子转运子 AcrB、间质融合蛋白 AcrA 和外膜通道蛋白 TolC。AcrAB 的表达水平受多种调控因子的调节，如 acrR. marA、mppA、sdiA、rob 和 soxS 等，其中，rob 是其中的一个正向调控因子。 选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌 5 株及大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922，分别以其染色体 DNA 为模板，通过 PCR 反应扩增出大肠杆菌多重耐 药调控基因 rob 片段，将上述基因片段分别与克隆载体 pMD18-T simple Vector 连接，连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态细胞中，对经酶切与 PCR 反应鉴定为阳性的克隆质粒进行插入片段的核苷酸序列测定。测序结果表明： 不同动物源性大肠杆菌的 rob 基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与 GeneBank 中该基因序列的同源性较高，核苷酸序列同源性在 98.799.9，氨基酸同源性在 98.6100.0。rob 基因突变位点是否影响了 rob 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待进一步研究。将重组质粒 pMD18-T-rob 和 pPICZA 分别用 Kpn和 Xba酶切后构建成表 达质粒 pPICZA-rob，构建后的重组质粒电转化进 GS115 酵母感受态细胞中， 阳性重组子甲醇诱导、目的基因酵母表达条件的优化(甲醇浓度、诱导时间、诱 导起始 OD600 值等)以及发酵上清浓缩液的 SDS-PAGE 电泳分析结果表明大肠杆 菌多重耐药调控基因 rob 在毕赤酵母中能够表达，表达的目的蛋白的分子量约 为 33 kDa，与预测的分子量大小相符。 本试验获得的临床分离大肠杆菌多 重耐药调控基因 rob 的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其 AcrAB-TolC 外输泵的调控机制提供参考；获得的 rob 基因表达蛋白，将为进一 步制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离 动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。 抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用，但是随着抗生素的 不恰当使用，由耐药菌株引起的人及动物感染性疾病不断增加，大肠杆菌耐药 及多重耐药现象已十分严重。主动外排系统可引起细菌对多种抗生素高频率、 高水平耐药。在大肠杆菌中发现存在 AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE 等主动 外排系统，其中 AcrAB-TolC 外排泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统。AcrAB- TolC 包括药物质子转运子 AcrB、间质融合蛋白 AcrA 和外膜通道蛋白 TolC。AcrAB 的表达水平受多种调控因子的调节，如 acrR. marA、mppA、sdiA、rob 和 soxS 等，其中，rob 是其中的一个正向调控因子。 选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌 5 株及大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922，分别以其染色体 DNA 为模板，通过 PCR 反应扩增出大肠杆菌多重耐 药调控基因 rob 片段，将上述基因片段分别与克隆载体 pMD18-T simple Vector 连接，连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态细胞中，对经酶切与 PCR 反应鉴定为阳性的克隆质粒进行插入片段的核苷酸序列测定。测序结果表明： 不同动物源性大肠杆菌的 rob 基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与 GeneBank 中该基因序列的同源性较高，核苷酸序列同源性在 98.799.9， 氨基酸同源性在 98.6100.0。rob 基因突变位点是否影响了 rob 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待进一步研究。将重组质粒 pMD18-T-rob 和 pPICZA 分别用 Kpn和 Xba酶切后构建成表 达质粒 pPICZA-rob，构建后的重组质粒电转化进 GS115 酵母感受态细胞中， 阳性重组子甲醇诱导、目的基因酵母表达条件的优化(甲醇浓度、诱导时间、诱 导起始 OD600 值等)以及发酵上清浓缩液的 SDS-PAGE 电泳分析结果表明大肠杆 菌多重耐药调控基因 rob 在毕赤酵母中能够表达，表达的目的蛋白的分子量约 为 33 kDa，与预测的分子量大小相符。 本试验获得的临床分离大肠杆菌多 重耐药调控基因 rob 的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其 AcrAB-TolC 外输泵的调控机制提供参考；获得的 rob 基因表达蛋白，将为进一 步制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离 动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。 抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用，但是随着抗生素的 不恰当使用，由耐药菌株引起的人及动物感染性疾病不断增加，大肠杆菌耐药 及多重耐药现象已十分严重。主动外排系统可引起细菌对多种抗生素高频率、 高水平耐药。在大肠杆菌中发现存在 AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE 等主动 外排系统，其中 AcrAB-TolC 外排泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统。AcrAB-TolC 包括药物质子转运子 AcrB、间质融合蛋白 AcrA 和外膜通道蛋白 TolC。AcrAB 的表达水平受多种调控因子的调节，如 acrR. marA、mppA、sdiA、rob 和 soxS 等，其中，rob 是其中的一个正向调控因子。 选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌 5 株及大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922，分别以其染色体 DNA 为模板，通过 PCR 反应扩增出大肠杆菌多重耐 药调控基因 rob 片段，将上述基因片段分别与克隆载体 pMD18-T simple Vector 连接，连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态细胞中，对经酶切与 PCR 反应鉴定为阳性的克隆质粒进行插入片段的核苷酸序列测定。测序结果表