基础兽医学专业毕业论文基础兽医学专业毕业论文 精品论文精品论文 我国部分地区我国部分地区 HP-PRRSVHP-PRRSV 分分子流行病学初步分析及子流行病学初步分析及 SDWFSDWF 株株 NSP2NSP2 蛋白的原核表达蛋白的原核表达关键词：猪繁殖与呼吸综合征关键词：猪繁殖与呼吸综合征 ORF5ORF5 基因基因 NSP2NSP2 基因基因 分子流行病学分子流行病学 原核表达原核表达摘要：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母 猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。高致病性猪蓝耳病(Highly Pathogenic Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus，HP- PRRSV)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株引起的一种急性高致死性传染病， 病毒致病力强，传播速度快，猪群发病率和死亡率高。本试验对我国部分省市 地区 HP-PRRS 分子流行病学进行了初步分析并实现了 NSP2 蛋白原核表达及初步 建立了检测 PRRSV 的间接 ELISA 方法。 本研究用细胞分离法从 8 省不同地区 发病猪场猪组织病料中分离到 28 株 PRRSV 流行毒株。扩增并测序获得 NSP2 基 因和 ORF5 基因片段序列，利用 DNA Star 软件对其进行核苷酸序列分析。分析 表明 28 个分离株 ORF5，NSP2 基因序列自身之间同源性分别为 94.799.8 和 86.499.8；与参考毒株 VR-2332、MLV、BJ-4、CH-1a、HB-1、HB-2 核 苷酸序列同源性 ORF5 为 86.298.5，87.790.5，87.489.9，90.296.4，95.2 97.4，90.993.5； NSP2 为 75.698.8，69.999.4，78.999.1，85.792.3，89.4 97.7，87.496.2，这说明国内流行毒株在 NSP2 和 ORF5 区域的变 异较大且表明全部分离株均属于美洲型毒株。 本文参考 Genbank 中收录的猪 繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome virus，PRRSV) JXA1 株 Nsp2 基因的序列，设计了一对引物用于扩增截短的 Nsp2(deleting Nsp2)基因，双酶切后将目的基因插入到原核表达载体 pET- 32a(+)中，转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行表达，经 SDS-PAGE 电泳和 Western- blot 检测和可溶性试验证明，Nsp2 得到了高效表达，融合蛋白的分子量约为 36.5ku，表达产物以可溶性方式存在于表达上清液中，表达产物能被 PRRSV 抗 体所识别，且具有较好的生物学活性。 用镍柱亲和层析法从上清中纯化了目 的蛋白，以纯化后的目的蛋白作为抗原包被聚乙烯微量反应板，初步建立检测 PRRSV 的间接 ELISA 方法。通过特异性、重复性、符合性等试验及对临床样品 检测的结果显示，该方法是一种较特异、敏感、快速、操作简便的方法。正文内容正文内容猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍 和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。高致病性猪蓝耳病(Highly Pathogenic Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV)是由猪繁 殖与呼吸综合征病毒变异毒株引起的一种急性高致死性传染病，病毒致病力强， 传播速度快，猪群发病率和死亡率高。本试验对我国部分省市地区 HP-PRRS 分 子流行病学进行了初步分析并实现了 NSP2 蛋白原核表达及初步建立了检测 PRRSV 的间接 ELISA 方法。 本研究用细胞分离法从 8 省不同地区发病猪场猪 组织病料中分离到 28 株 PRRSV 流行毒株。扩增并测序获得 NSP2 基因和 ORF5 基 因片段序列，利用 DNA Star 软件对其进行核苷酸序列分析。分析表明 28 个分 离株 ORF5，NSP2 基因序列自身之间同源性分别为 94.799.8和 86.499.8；与参考毒株 VR-2332、MLV、BJ-4、CH-1a、HB-1、HB-2 核苷 酸序列同源性 ORF5 为 86.298.5，87.790.5，87.489.9，90.296.4，95.2 97.4，90.993.5； NSP2 为 75.698.8，69.999.4，78.999.1，85.792.3，89.4 97.7，87.496.2，这说明国内流行毒株在 NSP2 和 ORF5 区域的变 异较大且表明全部分离株均属于美洲型毒株。 本文参考 Genbank 中收录的猪 繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome virus，PRRSV) JXA1 株 Nsp2 基因的序列，设计了一对引物用于扩增截短的 Nsp2(deleting Nsp2)基因，双酶切后将目的基因插入到原核表达载体 pET- 32a(+)中，转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行表达，经 SDS-PAGE 电泳和 Western- blot 检测和可溶性试验证明，Nsp2 得到了高效表达，融合蛋白的分子量约为 36.5ku，表达产物以可溶性方式存在于表达上清液中，表达产物能被 PRRSV 抗 体所识别，且具有较好的生物学活性。 用镍柱亲和层析法从上清中纯化了目 的蛋白，以纯化后的目的蛋白作为抗原包被聚乙烯微量反应板，初步建立检测 PRRSV 的间接 ELISA 方法。通过特异性、重复性、符合性等试验及对临床样品 检测的结果显示，该方法是一种较特异、敏感、快速、操作简便的方法。 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍 和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。高致病性猪蓝耳病(Highly Pathogenic Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV)是由猪繁 殖与呼吸综合征病毒变异毒株引起的一种急性高致死性传染病，病毒致病力强， 传播速度快，猪群发病率和死亡率高。本试验对我国部分省市地区 HP-PRRS 分 子流行病学进行了初步分析并实现了 NSP2 蛋白原核表达及初步建立了检测 PRRSV 的间接 ELISA 方法。 本研究用细胞分离法从 8 省不同地区发病猪场猪 组织病料中分离到 28 株 PRRSV 流行毒株。扩增并测序获得 NSP2 基因和 ORF5 基 因片段序列，利用 DNA Star 软件对其进行核苷酸序列分析。分析表明 28 个分 离株 ORF5，NSP2 基因序列自身之间同源性分别为 94.799.8和 86.499.8；与参考毒株 VR-2332、MLV、BJ-4、CH-1a、HB-1、HB-2 核苷 酸序列同源性 ORF5 为 86.298.5，87.790.5，87.489.9，90.296.4，95.297.4，90.993.5； NSP2 为 75.698.8，69.999.4，78.999.1，85.792.3，89.4 97.7，87.496.2，这说明国内流行毒株在 NSP2 和 ORF5 区域的变 异较大且表明全部分离株均属于美洲型毒株。 本文参考 Genbank 中收录的猪 繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome virus，PRRSV) JXA1 株 Nsp2 基因的序列，设计了一对引物用于扩增截短的 Nsp2(deleting Nsp2)基因，双酶切后将目的基因插入到原核表达载体 pET- 32a(+)中，转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行表达，经 SDS-PAGE 电泳和 Western- blot 检测和可溶性试验证明，Nsp2 得到了高效表达，融合蛋白的分子量约为 36.5ku，表达产物以可溶性方式存在于表达上清液中，表达产物能被 PRRSV 抗 体所识别，且具有较好的生物学活性。 用镍柱亲和层析法从上清中纯化了目 的蛋白，以纯化后的目的蛋白作为抗原包被聚乙烯微量反应板，初步建立检测 PRRSV 的间接 ELISA 方法。通过特异性、重复性、符合性等试验及对临床样品 检测的结果显示，该方法是一种较特异、敏感、快速、操作简便的方法。 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍 和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。高致病性猪蓝耳病(Highly Pathogenic Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus，HP-PRRSV)是由猪繁 殖与呼吸综合征病毒变异毒株引起的一种急性高致死性传染病，病毒致病力强， 传播速度快，猪群发病率和死亡率高。本试验对我国部分省市地区 HP-PRRS 分 子流行病学进行了初步分析并实现了 NSP2 蛋白原核表达及初步建立了检测 PRRSV 的间接 ELISA 方法。 本研究用细胞分离法从 8 省不同地区发病猪场猪 组织病料中分离到 28 株 PRRSV 流行毒株。扩增并测序获得 NSP2 基因和 ORF5 基 因片段序列，利用 DNA Star 软件对其进行核苷酸序列分析。分析表明 28 个分 离株 ORF5，NSP2 基因序列自身之间同源性分别为 94.799.8和 86.499.8；与参考毒株 VR-2332、MLV、BJ-4、CH-1a、HB-1、HB-2 核苷 酸序列同源性 ORF5 为 86.298.5，87.790.5，87.489.9，90.296.4，95.2 97.4，90.993.5； NSP2 为 75.698.8，69.999.4，78.999.1，85.792.3，89.4 97.7，87.496.2，这说明国内流行毒株在 NSP2 和 ORF5 区域的变 异较大且表明全部分离株均属于美洲型毒株。 本文参考 Genbank 中收录的猪 繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome virus，PRRSV) JXA1 株 Nsp2 基因的序列，设计了一对引物用于扩增截短的 Nsp2(deleting Nsp2)基因，双酶切后将目的基因插入到原核表达载体 pET- 32a(+)中，转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行表达，经 SDS-PAGE 电泳和 Western- blot 检测和可溶性试验证明，Nsp2 得到了高效表达，融合蛋白的分子量约为 36.5ku，表达产物以可溶性方式存在于表达上清液中，表达产物能被 PRRSV 抗 体所识别，且具有较好的生物学活性。 用镍柱亲和层析法