第十四章. 组化和免疫组化染色结果的定量测定 (The Quantitation Assay of Histochemistry B. 精索静脉曲张(ELV) 2周组周; C. ELV4周. 附睾体部: D. 左侧假手术对照组; E. ELV2周; F. ELV4周. 4ELV大鼠睾丸和附睾SPAG11E免疫组化灰度值测定结果: 睾丸: ELV 2周和4周组SPAG11E蛋白的平均灰度值与其相应的对照组 比较未见明显改变(P0. 05); 附睾: ELV2周和 4周组SPAG11E蛋白的表达均较同期对照组显著减弱 (P0. 05或P0. 01), ELV4周组附睾SPAG11E蛋白的表达较ELV2周组显著 减弱(P0. 01). 5II. 显微分光光度术 A. 简介: 细胞分光光度计(cytospectrophotometer), 是一种 以物质分子对光波的选择性吸收为基础, 对生物样品中 的化学物质进行定量测定的精密仪器. 通过测定核酸, 蛋 白质, 脂类, 酶类或其它化学成分的光吸收和微区面积而 计算它们的相对含量. B. 主要结构和工作原理: 1. 光源: 有白炽灯和汞灯, 疝灯. 白炽灯可作为标准光源, 辐射光谱在400700nm间, 用于一般测量. 汞灯为激发荧光 的理想光源, 疝灯的辐射光谱在2501100nm间. 2. 单色器和滤光片: 保证进入显微镜的光波亮度充足, 波 长单一且可调. 3. 光电组合件: 将测量区内的光学信号转变为电子信号, 产生测量数据.6C. 基本步骤: 1. 标本制备: 凡是显示细胞内化学物质的各种组化和免疫组 化染色标本均可用显微分光光度计对单个细胞进行定量测 定, 但标本内不能有双重染色且染色要保持均匀一致. 72. 测量方法: a. 单波长法: 用一种波长的光测量, 所测物质分布如果是均 匀的, 因此测量法所得数值, 其误差就小. b. 扫描测量法: 能够消除由于吸光物质分布不均匀而造成的 分布误差, 和由于面积不规则造成的面积测量误差. 扫描法 的原理是通过积分的方法, 虽然被测物质分布不均匀, 但可 以将被测物质的面积分成许多小区, 将各个小区的数值相加. c. 荧光光度法: 凡被测物质能产生荧光(原发荧光, 诱发荧光, 荧光或免疫荧光标记)的都可以应用荧光光度法测定. 广泛用 于测定细胞内的核酸(DNA和RNA), 氨基酸, 蛋白质, 糖原, 生 物胺, 抗体和酶的相对含量. D. 应用范围: 对细胞的DNA, RNA, 蛋白质, 酶, 糖, 脂等大分 子物质以及免疫活性物质等都能定性, 定位和定量测定. 8III. 流式细胞术 A. 简介: 可对单个细胞逐个地进行高速准确的定量分析和分 类, 每秒测定达数千万个细胞, 且有高度的重复性. 在单个 细胞中, 可同时测得DNA, RNA及细胞体积3个参数, 也可测 定核与细胞的比例, 蛋白质和免疫标记的其它参量. B. 主要结构和工作原理: 1. 液流系统: 先制备荧光等染色的单细胞悬液, 放入样品管 中, 使其在气体压力下进入流动室; 流动室内充满鞘液, 在 鞘液的约束下, 细胞排列成单行, 由流动室的喷嘴喷出, 成 为细胞柱液, 依次恒速通过测量区. 2. 激发光器件: 在测量区内发射波长可调的激光柱, 垂直照 射细胞液柱, 细胞受激光照射后发生散射光和荧光. 93. 信号检测系统: 测定细胞发出荧光的角度, 波长和大小, 可知细胞的体积和细胞内某种物质的含量. 4. 控制系统: 校准调节上述系统. 10C. 样品染色: 绝大多数用荧光染料进行标记. 1. DNA含量: 溴化乙啶(EB)和碘化丙啶(PI)嵌插入DNA的 双螺旋; 神光霉素与G-C有特异性; Hoechst33258与A-T有 特异性; 吖啶橙(Acridine orange, AO)可以同时染色DNA 和RNA. 2. 细胞核: DAPI (4, 6-二脒基-2-苯基吲哚 )是专与细胞核 结合的荧光素. 3. 蛋白质含量: 一般用异硫氰酸荧光素(FITC). 4. 外周T, B和单核细胞以及T细胞的亚群分选: 结合特 异性单克隆抗体. 11D. 应用举例: 1. 肿瘤学(Oncology): 绝大多数肿瘤从空间与时间上都显示 出稳定的多倍体DNA含量, 而且常常是非整倍体数. FCM能 诊断异常的DNA干系, 可作为指导肿瘤的治疗, 了解病情 发展, 判断预后和肿瘤治疗药物筛选等的有力证据. 2. 细胞凋亡(Apoptosis): 细胞凋亡是细胞程序性死亡, 其特 征是染色体断裂和DNA片段化, 凝胶电泳呈现梯状条带; 细胞皱缩, 致密并迅速破碎形成凋亡小体, 而被邻近细胞 所吞噬. 细胞凋亡时需要继续合成DNA, 蛋白质和ATP. FCM 检测分析可见DNA G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰(又称亚 G1峰), 代表细胞凋亡, 该峰下的面积即是凋亡细胞的相对 数量, 可由FCM自动给出. 12FCM检测HL-60细胞凋亡. 西安交通 大学医学院人体解剖与组胚专业博 士生杜宝玲, 2005. A图中可见明显的亚G1峰(25.9%), 提 示细胞凋亡. B图和C图显示两种Caspase-3反义寡 核苷酸转染干扰后, 亚G1峰消失.13IV. 激光扫描共聚焦显微镜术 A. 简介: 以激光和计算机技术为 基础把普通LM和荧光LM功能相 结合, 用激光扫描进行“光学切 片”, 显微镜进行微观检测, 计算 机对资料高速实时存储和分析, 将形态学的定量观察, 生理学的 动态检测和生物化学的定量分析 融为一体, 从而使对被检物体的 表面, 单层, 静态, 局部的观察 进展到立体, 断层扫描, 动态, 全面的观察. 14B. 特点: 1. 分辨率高: LSCM以激光为光源, 观察标本的反差明显, 最 小可观察厚度为0.5m. 2. 灵敏度高: 采用光电倍增管来检测荧光, 并利用不同的滤 片可将不同的光分开. 3. 扫描速度快: 可达微秒级. 因此可动态观察细胞内化学成 分如Ca2+, Mg2+和pH值的变化, 也可对膜电位, 膜的流动性等 进行测定. 4. 光学切片与细胞CT : 将样品各深度的切片叠加在一起进行 三维重组, 观察不同断面中细胞成分的变化, 即“细胞CT”. 5. 图像存取方便: 计算机可快速及时保存图像, 其数据存取 方便, 可随时调用. 15C. 功能: 1. 静态观察: a. 单染色样品的观察和分析: 可对一种荧光标记的样品进 行观察和分析, 获得细胞平均荧光强度, 积分荧光强度, 细胞的周长, 截面积和形态因子等参数. b. 双染色样品的观察和分析: 可将同一部位的不同扫描图 像叠加起来, 用于双染, 三染甚至四染样品, 但需注意各 种荧光染料的激发和发射波长互不干扰. c. 自动图像扫描观察分析: 用于一个平皿中多个散在并可 能同时发生变化的细胞的同时观察. d. 荧光强度的定量测定: 用于高灵敏度快速的免疫荧光测 定, 以准确地监测抗原表达, 细胞结合和杀伤及定量的形 态学特性.162. 动态观察: a. 细胞内各种离子浓度的测定: 用于动态观察一段时间内 细胞内Ca2+, Mg2+, pH值的变化并可进行定量测定. 其点扫 描, 线扫描和图像扫描可分别观察微秒级和毫秒级的快速 变化. b. 细胞膜流动性测定: 细胞膜荧光探针受到极化光线激发 后, 其发射光的极性依赖于荧光分子的旋转, 而这种有序 的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性. 173. 生物活性物质笼锁(Caged)和解笼锁(Uncaged)的测定: 笼 锁化合物与生物活性物质(如第二信使, 核苷酸, 神经递质 , Ca2+等)结合可抑制后者的活性, 使其处于笼锁状态. 当 用LSCM强度和时间可人为控制的特异性波长的光瞬间照 射后, 光活化解笼锁, 使该活性物质释放, 其直接在光解 部位发挥的作用为LSCM所检测. 4. 贴壁细胞的分选: 用高能量激光杀灭不需要的细胞(荧 光标记), 留下需要的活细胞继续培养.185. 荧光光漂白恢复(Fluorescence recovery after photobleach, FRAP): 用来测定活细胞的动力学参数. FRAP借助高强度脉冲 激光来照射细胞某一区域, 造成该区域荧光分子的光粹灭, 该 区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩 散, 这个扩散速率可通过LSCM探测, 得到分子运动和胞间通 讯等动力学参数. 6. 激光光陷阱技术: 即光摄技术, 广泛应用于染色体移动, 细 胞器移动, 细胞骨架弹性测量, 细胞周期和调控研究及分子动 力原研究等. 利用光学梯度力形成的光陷阱, 产生具有传统机 械挟持和操纵微小物体的功能. 当微米级颗粒落入一个非均匀 光场中, 它将趋于特定的平衡位置, 物体不会偏离光学中心, 造成一个势能较低的陷阱区域, 这种固定是光子动量的结果, 与照明强度和波长有关. 19Overlapping distributions of corticothalamic (皮质丘脑) and (丘脑 皮层) thalamocortical pathways. Early postnatal mouse.GABA-containing terminals (red) in close apposition to oxytocin neurons (green). Rat hypothalamus. 20V. 显微照相与白平衡 A. 绝对黑体: 物体对电磁波具有吸收, 透过, 反射三种 作用, 分别以吸收率, 透过率, 反射率衡量, 此三者相 加等于1. 吸收率为1而其它两项为0的物体称绝对黑 体. 透过率为1的叫绝对透明体. 反射率为1, 表面光滑 的叫镜体, 不光滑的叫白体. 这几种物质在现实中是 不存在的, 是理想的情况. B. 色温: 1. 概念: 是表示光源光谱质量最通用的指标, 按绝对 黑体来定义, 单位为K. 光源的辐射在可见区和绝对黑 体的辐射完全相同时, 黑体的温度就称此光源的色温. 光线的色温是相当于黑体散发出同样颜色时所受到 的“温度”. 212. 色温的相对性: 色温是物理学, 生理学与心理学 的综合复杂因素的一种感觉, 因人而异. 黑眼睛的 人看9300K是白色的, 因此摄影照相的色温以9300K 为基准, 但是蓝眼睛的人看了就是偏蓝. 6500K蓝眼 睛的人看了是白色, 黑眼睛看了就是偏黄.色温图22C. 白平衡与显微照相: 1. 白平衡(White balance): 在任何光源下, 都能将白色物 体还原为白色. 2. 调节白平衡原理: 摄像机内部有三种CCD电子耦合元 件,分别感受蓝色, 绿色,和红色的光线, 在预置情况下感 光电路电子放大比例是1:1:1. 若照片偏蓝, 色温较高, 白 平衡调整后的电路放大比例中明显蓝的比例减少, 增加 了绿和红的比例, 使所成影像依然为白色 .23Mount Sharp, Mars, before WB.Mount Sharp, Mars, after WB.24Trachea, after and after WB 25