妇产科学专业优秀论文妇产科学专业优秀论文 脐带基质干细胞在不同诱导条件下向生殖脐带基质干细胞在不同诱导条件下向生殖细胞分化的实验研究细胞分化的实验研究关键词：卵巢早衰关键词：卵巢早衰 脐带基质干细胞脐带基质干细胞 细胞分化细胞分化 生殖细胞生殖细胞 干细胞移植干细胞移植摘要：目的：1.建立分离培养脐带基质干细胞(umbilical cord matrix stem cells，UC-MSCs)的方法，了解其生物学特性及分化潜能。2.探讨体外微环境对 UC-MSCs 向生殖细胞分化的影响。3.观察 UC-MSCs 移植后在小鼠早衰卵巢中的 分布及生长，探讨体内微环境对 UC-MSCs 分化的影响。 方法：1.无菌条件下 取正常足月顺产新生儿的脐带，用 I 型胶原酶消化，分离单个核细胞，DMEM 培 养，获得贴壁细胞，监测细胞生长曲线、流式细胞仪检测其免疫表型。采用不 同条件培养基诱导细胞向成脂、成骨、成肌方向分化 2.采用两种方法对 UC- MSCs 进行诱导分化，观察体外微环境对 UC-MSCs 分化的影响。类胚体诱导： 将 UC-MSCs 进行悬滴培养，使其形成类胚体(embryonic body，EB)，进而采用 将 EB 与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养、卵泡液培养等方法，体外诱导 UC-MSCs 向早期生殖细胞分化。通过 RT-PCR 方法检测特异性基因的表达，免疫组化和流 式细胞术检测其免疫表型，观察是否有生殖系特异性标记物的表达。单层细 胞诱导：采用卵泡液作为条件培养基，体外诱导 UC-MSCs 向生殖细胞分化。3. 通过 60Co 射线照射处理建立卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)动 物模型，慢病毒介导绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)转染 UC- MSCs，经尾静脉移植于 POF 小鼠体内。在不同时间点取材，通过共聚焦显微镜 和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)方法检测移植 细胞在小鼠体内的分布和生长情况；通过计数非闭锁始基卵泡数目和测定雌激 素水平等方法观察卵巢的损伤修复情况。 结果：1.分离的脐带单个核细胞培 养后呈纺锤体样，体外增殖达 10 代以上，P3 代细胞中 80 以上处于 G0/ G1 期， 约 20的细胞处于 S+G2+M 期。其分子免疫表型为：CD44、CD73、CD90、CD105 阳性，CD31、CD34、CD45、HLA-DR 阴性，与骨髓间充质干细胞的免疫表型相似。 在不同的诱导条件下，UC-MSCs 可向成脂、成骨、成肌方向分化。2.诱导分化 培养结果将 UC-MSCs 进行悬滴培养，其能够形成 EB。RT-PCR 结果发现：EB 形成后 5 天表达生殖系标记物 Oct-4、Ifitm-3、stella、vasa、DAZL，作为对 照的 UC-MSCs 仅表达 Oct-4、Ifitm-3、stella。流式细胞术检测结果：EB 形 成 5 天后，其中 SSEA-1 阳性细胞占 15.61。免疫组化检测结果：形成后 5 天的 EB 与人或小鼠的卵巢颗粒细胞共培养，10 天后生殖系标记物 stella、vasa、SCP3、GDF-9 阳性表达，而颗粒细胞及采用卵泡液培养的 EB 均 无表达。单层细胞培养诱导：UC-MSCs 用含 5卵泡液培养基诱导 20 天后， 细胞卷曲形成类组织样团块，团块周边不断有悬浮细胞生成并随之脱落，未检 测到生殖系特异性标记物的表达。3.60Co 射线处理后病理切片提示：小鼠 短期内即出现卵巢储备下降、卵泡闭锁、卵巢萎缩等 POF 样病变，大脑、肝脏、 肺脏、肾脏、心脏、脾脏、肠道、骨髓等组织未见明显病理损伤，说明模型构 建成功。慢病毒介导 GFP 转染 UC-MSCs 的效率达 80以上；UC-MSCs 经尾静 脉移植后，在受损小鼠卵巢中可发现大量 GFP 阳性细胞存活生长，但在大脑、 肝脏、肺脏、肾脏、心脏、脾脏、脊髓、肠道等组织中均未发现 GFP 阳性细胞 存在。卵泡计数和雌激素测定均提示移植 UC-MSCs 组小鼠卵巢损伤修复情况比没有移植 UC-MSCs 组小鼠修复情况好。 结论：1.人 UC-MSCs 可在体外培养、 扩增，细胞免疫表型与 BM-MSCs 相似，具有成脂、成骨、成肌等多向分化潜能， 是一种理想的成体干细胞来源。2.UC-MSC 体外悬滴培养可形成 EB，与人或小鼠 卵巢颗粒细胞共培养后均表达生殖系标记物，提示体外微环境对 UC-MSCs 向生 殖细胞方向分化发挥十分重要的作用。3.UC-MSCs 移植后能够迁移至功能早衰 卵巢并存活生长，卵泡计数和 E2 水平提示 UC-MSCs 可能具有卵巢损伤修复作用， 表明体内微环境对 UC-MSCs 的的分化也发挥重要作用。正文内容正文内容目的：1.建立分离培养脐带基质干细胞(umbilical cord matrix stem cells，UC-MSCs)的方法，了解其生物学特性及分化潜能。2.探讨体外微环境对 UC-MSCs 向生殖细胞分化的影响。3.观察 UC-MSCs 移植后在小鼠早衰卵巢中的 分布及生长，探讨体内微环境对 UC-MSCs 分化的影响。 方法：1.无菌条件下 取正常足月顺产新生儿的脐带，用 I 型胶原酶消化，分离单个核细胞，DMEM 培 养，获得贴壁细胞，监测细胞生长曲线、流式细胞仪检测其免疫表型。采用不 同条件培养基诱导细胞向成脂、成骨、成肌方向分化 2.采用两种方法对 UC- MSCs 进行诱导分化，观察体外微环境对 UC-MSCs 分化的影响。类胚体诱导： 将 UC-MSCs 进行悬滴培养，使其形成类胚体(embryonic body，EB)，进而采用 将 EB 与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养、卵泡液培养等方法，体外诱导 UC-MSCs 向早期生殖细胞分化。通过 RT-PCR 方法检测特异性基因的表达，免疫组化和流 式细胞术检测其免疫表型，观察是否有生殖系特异性标记物的表达。单层细 胞诱导：采用卵泡液作为条件培养基，体外诱导 UC-MSCs 向生殖细胞分化。3. 通过 60Co 射线照射处理建立卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)动 物模型，慢病毒介导绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)转染 UC- MSCs，经尾静脉移植于 POF 小鼠体内。在不同时间点取材，通过共聚焦显微镜 和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)方法检测移植 细胞在小鼠体内的分布和生长情况；通过计数非闭锁始基卵泡数目和测定雌激 素水平等方法观察卵巢的损伤修复情况。 结果：1.分离的脐带单个核细胞培 养后呈纺锤体样，体外增殖达 10 代以上，P3 代细胞中 80 以上处于 G0/ G1 期， 约 20的细胞处于 S+G2+M 期。其分子免疫表型为：CD44、CD73、CD90、CD105 阳性，CD31、CD34、CD45、HLA-DR 阴性，与骨髓间充质干细胞的免疫表型相似。 在不同的诱导条件下，UC-MSCs 可向成脂、成骨、成肌方向分化。2.诱导分化 培养结果将 UC-MSCs 进行悬滴培养，其能够形成 EB。RT-PCR 结果发现：EB 形成后 5 天表达生殖系标记物 Oct-4、Ifitm-3、stella、vasa、DAZL，作为对 照的 UC-MSCs 仅表达 Oct-4、Ifitm-3、stella。流式细胞术检测结果：EB 形 成 5 天后，其中 SSEA-1 阳性细胞占 15.61。免疫组化检测结果：形成后 5 天的 EB 与人或小鼠的卵巢颗粒细胞共培养，10 天后生殖系标记物 stella、vasa、SCP3、GDF-9 阳性表达，而颗粒细胞及采用卵泡液培养的 EB 均 无表达。单层细胞培养诱导：UC-MSCs 用含 5卵泡液培养基诱导 20 天后， 细胞卷曲形成类组织样团块，团块周边不断有悬浮细胞生成并随之脱落，未检 测到生殖系特异性标记物的表达。3.60Co 射线处理后病理切片提示：小鼠 短期内即出现卵巢储备下降、卵泡闭锁、卵巢萎缩等 POF 样病变，大脑、肝脏、 肺脏、肾脏、心脏、脾脏、肠道、骨髓等组织未见明显病理损伤，说明模型构 建成功。慢病毒介导 GFP 转染 UC-MSCs 的效率达 80以上；UC-MSCs 经尾静 脉移植后，在受损小鼠卵巢中可发现大量 GFP 阳性细胞存活生长，但在大脑、 肝脏、肺脏、肾脏、心脏、脾脏、脊髓、肠道等组织中均未发现 GFP 阳性细胞 存在。卵泡计数和雌激素测定均提示移植 UC-MSCs 组小鼠卵巢损伤修复情况 比没有移植 UC-MSCs 组小鼠修复情况好。 结论：1.人 UC-MSCs 可在体外培养、 扩增，细胞免疫表型与 BM-MSCs 相似，具有成脂、成骨、成肌等多向分化潜能， 是一种理想的成体干细胞来源。2.UC-MSC 体外悬滴培养可形成 EB，与人或小鼠 卵巢颗粒细胞共培养后均表达生殖系标记物，提示体外微环境对 UC-MSCs 向生殖细胞方向分化发挥十分重要的作用。3.UC-MSCs 移植后能够迁移至功能早衰 卵巢并存活生长，卵泡计数和 E2 水平提示 UC-MSCs 可能具有卵巢损伤修复作用， 表明体内微环境对 UC-MSCs 的的分化也发挥重要作用。 目的：1.建立分离培养脐带基质干细胞(umbilical cord matrix stem cells，UC-MSCs)的方法，了解其生物学特性及分化潜能。2.探讨体外微环境对 UC-MSCs 向生殖细胞分化的影响。3.观察 UC-MSCs 移植后在小鼠早衰卵巢中的 分布及生长，探讨体内微环境对 UC-MSCs 分化的影响。 方法：1.无菌条件下 取正常足月顺产新生儿的脐带，用 I 型胶原酶消化，分离单个核细胞，DMEM 培 养，获得贴壁细胞，监测细胞生长曲线、流式细胞仪检测其免疫表型。采用不 同条件培养基诱导细胞向成脂、成骨、成肌方向分化 2.采用两种方法对 UC- MSCs 进行诱导分化，观察体外微环境对 UC-MSCs 分化的影响。类胚体诱导： 将 UC-MSCs 进行悬滴培养，使其形成类胚体(embryonic body，EB)，进而采用 将 EB 与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养、卵泡液培养等方法，体外诱导 UC-MSCs 向早期生殖细胞分化。通过 RT-PCR 方法检测特异性基因的表达，免疫组化和流 式细胞术检测其免疫表型，观察是否有生殖系特异性标记物的表达。单层细 胞诱导：采用卵泡液作为条件培养基，体外诱导 UC-MSCs 向生殖细胞分化。3. 通过 60Co 射线照射处理建立卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)动 物模型，慢病毒介导绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)转染 UC- MSCs，经尾静脉移植于 POF 小鼠体内。在不同时间点取材，通过共聚焦显微镜 和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)方法检测移植 细胞在小鼠体内的分布和生长情况；通过计数非闭锁始基卵泡数目和测定雌激 素水平等方法观察卵巢的损伤修复情况。 结果：1.分离的脐带单个核细胞培 养后呈纺锤体样，体外增殖达 10 代以上，P3 代细胞中 80 以上处于 G0/ G1 期， 约 20的细胞处于 S+G2+M 期。其分子免疫表型为：CD44、CD73、CD90、CD105 阳性，CD31、CD34、CD45、HLA-DR 阴性，与骨髓间充质干细胞的免疫表型相似。 在不同的诱导条件下，UC-MSCs 可向成脂、成骨、成肌方向分化。2.诱导分化 培养结果将 UC-MSCs 进