*高中生物高中生物选修选修1 1 专题专题2 2 微生物培养与应用微生物培养与应用主要主要 内容内容*u大肠杆菌的纯化培养；u分解尿素的细菌的计数;u分解纤维素微生物的分离。1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至1000mlNacl 5g蛋白胨 10g牛肉膏 5g琼脂20.0g大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.计算：培养基用量 依配方计算各成分的用量2.称量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取 牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解 取纸蛋白胨、NaCl琼脂 补水定容4.调pH、分装、封口：5.灭菌： 6.倒平板：培养基、培养皿分散成单个细胞,形成单个菌落倒平板倒平板约50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌， 防止瓶口的微生物污染培养基大肠杆菌的纯化培养： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：平板划线法：菌种划3个平板 1个不划线1.接种：接种环防止划破培养基（重复实验）（空白对照）平板划线法为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要 灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧 接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环 上可能存在的微生物污染培养物杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时， 菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次 数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以 便得到菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污 染环境和感染操作者。6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：菌液微量 移 液器稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液： b.涂布平板：不超过0.1ml 各梯度分别涂布3个平板 1个不涂布作空白对照滴灼试涂稀 释 103 倍稀 释 104 倍稀 释 105 倍平板划线法：大肠杆菌的纯化培养： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：1.接种：稀释涂布平板法：2.培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基 放入37恒温箱中培养12h24h后，观察并记录菌种的保藏：1.临时保藏： 试管固体斜面培养基上 42.长期保存：菌种易被污染、变异甘油管藏1ml甘油1ml菌液20复习尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。 只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸 收利用CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3细菌脲酶u筛选菌株提出的问题 如何寻找耐高温的酶？解决问题的思路寻找耐高温环境；原理高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。u筛选菌株 选择培养基：允许特定种类 的微生物生长，同时抑制或 阻止其他种类微生物生长的 培养基。u筛选菌株 KH2PO4 1.4gNaHPO4 2.1gMgSO4 H2O 0.2g葡萄糖 10.0g尿素 1.0g琼脂 15.0g将上述物质溶解后 ，用蒸馏水定容到 1000mL。该培养基的配方中，为 微生物的生长提供碳源和氮 源的分别是什么物质？此配方能否筛选出产生 脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素能。只有产生脲酶的 细菌能利用尿素作为氮 源而生存。u统计菌落数目：1、活体计数法（稀释涂布平板）（1）操作方法：稀释涂布平板统计菌落数（2）原理：1个菌落1个活菌（3）统计原则选 30 300 个菌落的平板统计每个稀释度取3个平板取其平均值为什么？u统计菌落数目1、活菌计数法（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的 实际数目低，因此统计结果一般用菌落数表 示。每克样品中的菌株数=（C/V)* MC:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。为什么？例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为 106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的 菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板， 统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个 平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题 ，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值2、显微观察法：比例计数或直接计数（血球计数板）计数室（中央大方格）的长、宽和高分别为： 1 mm 、1 mm和 0.1mm 计数室的容积：0.1mm3 （万分之一毫升） 取样：稀释一定倍数的菌液酵母细胞数/ml80小格内酵母细胞个数 /80400104稀释倍数 计数顺序：左上右上右下左下 压在格线的，只统计左线和上线3.称重法：一个细胞（细菌）一般重约10121013g4.比浊法记数 当细菌浓度达到107个/ml时,培养基会浑浊利用选择培养基进行尿素分解菌的分离 过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A 、B两同学分别得到以下两种统计结果。1、A同学筛选出150个菌落。2、B同学筛选出50个菌落。B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基 中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿 素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己 的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。请你帮助A同学改进实验，提供具有说明 了的证据。设置对照同等条件下，培养空白培养基u设置对照1、设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对实验结 果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了 被测试 的条件外 ，其他条件都 相同 的实验。满足该条 件的称为 对照组，未满足该条件的称 为 实验 组。尿素培养基未接种的尿 素培养基10-510-4实验过程 （一）土壤取样 1、取样的位置：土壤，天然培养基，含有大量的微生物， 其中70 90是细菌。在富含有机质的土壤层 的3 8cm处中分布着绝大多数的细菌。2、取样要求：铲去表层土。菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养（二）样品稀释（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液 原则：确保平板上的菌落数在30 300之间。 （三）微生物的培养与观察1、接种：用适当的稀释液作涂布平板2、培养：细菌：30 37，1 2d;放线菌:25 28, 5 7d;霉菌: 25 28, 3 4d.3、观察：a.每24h统计一次菌落数目b.以“稳定菌落”为观察对象（四）鉴定 鉴别培养基：不影响 微生物的生存 酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌 原理：脲酶催化尿素 分解成氨培养基碱性 增强 酚红变红脲 酶阳性复习纤维素酶是一种复合酶，一般 认为它至少包括三种组分，即C1酶、 CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤 维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤 维二糖分解成葡萄糖。纤维素纤维二 糖葡萄糖C1酶 Cx酶葡萄糖 苷酶背景知识滤 纸 崩 溃 法纤维素酶活性的测定实验：背景知识刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当 纤维素被纤维素酶分解 后，红色复合物无法形 成，出现以纤维素分解 菌为中心的透明圈，我 们可以通过是否产生透 明圈来筛选纤维素分解 菌。背景知识实验流程示意图一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理三、所需仪器、材料、用具和药品三、所需仪器、材料、用具和药品四、实验的方法和步骤四、实验的方法和步骤五、分析结果五、分析结果实验设计一、实验目的一、实验目的1 1、利用特定的选择培养基和鉴别培养基从、利用特定的选择培养基和鉴别培养基从 土壤中分离分解纤维素的微生物。土壤中分离分解纤维素的微生物。2 2、掌握刚果红染色的机理和操作。、掌握刚果红染色的机理和操作。实验设计1 1、以纤维素为碳源的选择培养基能选择、以纤维素为碳源的选择培养基能选择 出分解纤维素的微生物。出分解纤维素的微生物。2 2、刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质、刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质 形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖 和葡萄糖发生这种反应。和葡萄糖发生这种反应。二、实验原理二、实验原理实验设计三、所需仪器、材料、用具和药品三、所需仪器、材料、用具和药品1 1、实验仪器与用具、实验仪器与用具除了分离分解尿素的细菌中用到的有除了分离分解尿素的细菌中用到的有 关仪器用具外，还需要恒温振荡培养箱。关仪器用具外，还需要恒温振荡培养箱。2 2、材料与药品、材料与药品实验设计四、实验的方法和步骤四、实验的方法和步骤1 1、配制培养基、配制培养基 2 2、灭菌、灭菌 3 3、土壤取样、土壤取样5 5、样品稀释、样品稀释 6 6、涂布接种、涂布接种4 4、选择培养、选择培养7 7、筛选菌落、筛选菌落实验设计配制培养基配制培养基实验设计灭菌灭菌酵母膏：实际上是膏状的酵母抽提物，酵母抽提物是 国家行业标准的规定名称。酵母抽提物以酵母为原料 ，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色而成 的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的产 品。水解酪素：微生物培养基的氨基酸氮源，由酪蛋白水 解得到，常见商品名称为水解酪素或酶解酪素。酪蛋 白水解后富含21种氨基酸，氨基酸种类齐全。因此常 用于制备培养基。CMC-Na：羧甲基纤维素钠，是天然纤维素经化学改性 后得到的纤维素衍生物，是纤维素的羧甲基醚化物。 实验设计思考：1.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分 解菌？2.将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应 该埋进土壤多深？土壤取样土壤取样将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对 聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的 适宜环境。一般将纸埋于深约10cm左右腐殖土 壤中。实验设计“浓缩 ”作用u将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶 中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度 下振荡培养1-2d，直至培养液变混浊。u吸取一定量的培养液，转移至另一瓶新鲜 的选择培养基中，以同样的方法培养到培 养液变混浊。（富集培养）（富集培养）选择培养选择培养根据样品中目的菌株数量来确定是否需要。实验设计样品稀释样品稀释实验设计涂布接种涂布接种鉴别纤维素分解菌的培养基挑选产生透明圈的菌落。挑取产生明显的 透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在 300C370C培养，可获得纯培养。筛选菌落筛选菌落实验设计刚果红染色法 方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行 颜色反应。方法二：在倒平板时就加入刚果红。实验设计复习微生物培养的基本程序培养基的配制称量溶化调pH分装包扎灭菌（高压蒸汽灭菌）接种固体培养基平板划线（接种环）、稀释涂布（玻璃刮刀） 液体培养基用接种环蘸取菌液（扩大培养）培养 固体培养基倒置，37恒温培养箱，24h左右 液体培养基空气浴或水浴培养箱（摇床），震荡培养固体培养基划线的末端出现单菌落 液体培养基培养液变浑浊观察 废弃菌种和培养基灭菌后丢弃 总结总结（2013新课标卷II）临床试用抗生素前，有时需要做细菌耐药 实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定 的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答 下列问题：（1）为了从样本中获取致病菌菌落，可用_法或 _法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴 别等步骤获得。（2）取该单菌落适当稀释，用_法接种于固体培养基 表面，在37培养箱中培养24h，使其均匀生长，布满平板。 【答案】：（1）划线 稀释涂布（或涂布）（2）涂布 （3）为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A，B，C，D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置， 培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病