细胞计数细胞计数 实验原理：实验原理： 当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作：具体操作： 一、准备工作： 取一瓶传代的细胞，待长成单层后以备使用。 二、细胞悬液制备： 细胞悬液的制备方法是用 0.25的胰蛋白酶液消化、PBS 液洗涤后，加入培养液（或 Hanks 液或 PBS 等平衡盐溶液） ，吹打制成待测细胞悬液。 三、细胞计数： 1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸 5 滴细胞悬液到一离心管中，加入 5 滴台盼蓝染液（0.4）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有 16 个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。 5.计算原细胞悬液的细胞数 L：按照下面公式计算细胞密度： （细胞悬液的细胞数）/ml（四个大格子细胞数/4)稀释倍数104 四、细胞计数要点： 1.进行细胞计数时， 要求悬液中细胞数目不低于 104 个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中； 2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确； 4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。 5.操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 初学者易犯的错误：初学者易犯的错误： 1.计数前未将待测悬液吹打均匀。 2.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 3.滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。 台盼蓝染色台盼蓝染色 基本性质基本性质 中英文名称：台盼蓝（Trypan Blue)或称台盼兰、锥虫蓝 分子式：C34H24N6O14S4Na4 分子量: 960.82 可溶于水（10mg/ml) 是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性。还常用于细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。 台盼蓝可被巨噬细胞吞噬，故可用于巨噬细胞的活体染色剂。 机理机理 正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡，这与中性红作用相反。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。台盼蓝是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一。注意凋亡小体也有台盼蓝拒染现象。 台盼蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。 台盼蓝染色只需 3-5 分钟即可完成，并且操作非常简单。 步骤步骤 1、4%台盼蓝母液：称取 4g 台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 100ml，用滤纸过滤，4 度保存。使用时。用 PBS 稀释至 0.4%。 （也可买 Gibco 的成品）; T$ d& ! h% l, E) Z) A- W 2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。 3、染色：细胞悬液与 0.4%台盼蓝溶液以 9:1 混合混匀。 （终浓度 0.04%） 4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。 5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。 6、统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）100% 其他其他 保存条件：室温保存 有潜在致癌危险 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。