多管发酵法测定水中大肠菌群,考查内容： 一、预习报告（包括提问） 二、操作（无菌操作，随机抽看） 三、实验报告,实验十一(综合实验）,多管发酵法测定水中大肠菌群,一、实验目的二、实验原理三、实验材料四、实验步骤五、实验报告,一、实验目的,1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。,发酵法： 又称多管发酵法或三步发酵法 1) 初发酵（推测试验）： 将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中（3倍或1倍乳糖液），经37 C培养24 h，观察产酸产气情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，以初步判断是否有大肠菌群存在。,二、实验原理,2）平皿分离（证实试验）,水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。 将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，37 C培养24 h，根据菌落特征（带核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。,3） 复发酵试验(完成实验）,将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍乳糖培养液中，经37 C培养24 h，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。 产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应； 根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。,三、实验材料,1、培养基： 乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。2、仪器或其他用具： 载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。,四、操作步骤,1水样的采取 实验室提供水样 2河水的检查（1）初（步）发酵实验 水样的稀释： 10-1与10-2 接种：分别吸取1ml 10-2 、 10-1和原水样接入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管 ；另取10ml原水样接入装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 ，混匀后，37 培养24 h，24 h未产气的继续培养48 h。,（2）平板分离 将经24 h和48 h培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 培养1824 h，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。 深紫黑色，有金属光泽； 紫黑色，不带或略带金属光泽； 淡紫红色，中心颜色较深。,（3）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复初步发酵试验。并根据初发酵管试验的阳性管查表，即得大肠菌群数。,图1 多管发酵测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释,五、思考题,1.实验结果报告 河水水样：阳性结果记“”，阴性结果记“”。 查表6获得每升水样中总大肠菌群是多少？2.思考题（1） 何谓大肠菌群，它主要包括哪些细菌属？（2） 为什么EMB培养基的琼脂平板能够作为检测大肠菌群的鉴别平板？,