第8章 紫外可见吸光光度法 及分子荧光分析法8.1 吸光光度法的基本原理 8.2 光度分析的方法和仪器 8.3 吸光光度法的灵敏度与准确 度 8.4 显色反应与分析条件的选择 8.5 吸光光度法的应用 8.6 紫外可见分光光度法在有机定性分析中的应用 8.7 分子荧光与分子磷光分析法1化学分析：常量组分(1%), Er : 0.1%0.2%依据化学反应, 使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较仪器分析：微量组分(1%), Er : 1%5%依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器例: 含Fe约0.05%的样品, 称0.2 g, 则m(Fe)0.1 mg重量法 m(Fe2O3)0.14 mg, 称不准容量法 V(K2Cr2O7)0.02 mL, 测不准光度法 结果0.048%0.052%, 满足要求准确度高灵敏度高2仪器分析方法分类2.电化学分析法: 依据物质的电化学性质及其变化 3.色谱法: 气相色谱, 液相色谱 4.质谱法、热分析法、放射化学法等非光谱法 （折射法，浊度法，旋光法） （不以光的波长为特征讯号）光谱法分子光谱法 UV/Vis,IR,MFS,MPS原子光谱法 AAS,AES, AFS（以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过 检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）光 学 分 析 法1. 光学分析法: 基于电磁辐射与物质的相互作用 .3分子光谱学*者为四大波谱*紫外可见分光光度法(UV/Vis)Ultra Violet/Visible Spectrophotometry *红外吸收光谱法(IR)Infrared Spectroscopy 分子荧光光谱法(MFS)Molecular Fluorescence Spectroscopy4光声光谱法 (PAS)Photo Acoustic Spectroscopy 拉曼光谱法 (RS)Raman Spectroscopy *核磁共振波谱法(NMR)Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy *质谱法 (MS)Mass Spectroscopy发展联用技术是趋势! 分子磷光光谱法(MPS)Molecular Phosphorescence Spectroscopy58.1 吸光光度法的基本原理特点 灵敏度高：测定下限可达10-510 -6molL-1, 10-4%10-5% 准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差25 （12） 操作简便快速 应用广泛吸光光度法是基于被测物质的分子对光具 有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。6I0It光强的 测量分光 光度计分光光度法 的应用：定 量测定与定 性分析物质对光有选择性 吸收 准备知识光强的减弱与物 质浓度的关系？ 朗伯-比尔定律测量光强 度的减弱78.1.1 光的基本性质 (电磁波的波粒二象性) c 真空中光速 2.99792458108m/s 3.0 108m/s 波长，单位：m,cm,mm,m,nm,1m=10-6m, 1nm=10-9m, 1=10-10m 频率，单位：赫芝(周)Hz 次/秒n 折射率，真空中为1光的传播速度:波动性8X磁场向量传播方向YZx电场向量9h普朗克(Planck)常数 6.62610-34Js频率E光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特) 1eV=1.6021019 J微粒性光量子，具有能量 。10结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低.单色光：具有相同能量(相同波长)的光.混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起. 例如白光.波粒二象性真空中:11电磁波谱及分析方法电电磁波长长 (cm)10-810-1310-610-910-410-610-410-110-410-110-210210-510.1100100 104104104107nm104004007807803105名称射线线X射线线紫外线线可见见光红红外线线短波中波能量(eV)1041091021051102110-3110-610-310-6能级跃级跃迁原子核内层电层电子外层层价电电子分子轨轨道电电子分子转动转动 或振动动未成对电对电 子的偶极 矩原子核的 偶极矩利用吸收的分 析方法射线线吸收 法X射线线吸 收法原子吸收法 紫外吸收法可见见光分光光 度法红红外吸收 分析顺顺磁共振核磁共振利用发发射的分 析方法活化分析X射线线 荧荧光 发发射X 射线线原子荧荧光分析 火焰光度分析 发发射光谱谱分析荧荧光分析 磷光分析 拉曼分析利用相互作用 的分析方法电电子射线线 分析X射线线 衍射分析比浊浊法旋光光谱谱法 圆圆偏光二向性 法12光学光谱区远远紫外近紫外 可见见近红红外 中红红 外远红远红 外 （真空紫外 ） 10nm200nm200nm380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m300 m138.1.2 物质对光的吸收与发射1. 电子相对于原子核的运动-电子能级;单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反.三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同.2. 原子核在其平衡位置附近的相对振动-振动能级;3. 分子本身绕其重心的转动-转动能级.物质分子内部3 种运动形式及其对应能级 ：14S2分子吸光与发光示意图Ee振动能级v3v2v1转动r3r2r1S1S0 紫外荧光磷光T2T1可见EvEr红外单重态 三重态系间窜跃15光谱种类原子光谱：吸收、发射、荧光线状光谱黑体辐射：白炽灯、液、固灼热发光连续光谱分子光谱：紫外、可见、红外等吸收光谱 带状光谱I16/nm颜颜色互补补光 400 450紫黄绿绿450 480蓝蓝黄 480 490绿蓝绿蓝橙 490 500蓝绿蓝绿红红 500 560绿绿红红紫 560 580黄绿绿紫 580 610黄蓝蓝 610 650橙绿蓝绿蓝650 760红红分子对光的吸收与吸收光谱不同颜色的可见光波长及其互补光蓝绿17熔融石英晶体石英玻璃NaCl170nm3.6m *200600nm2m 3.5m*360nm2.5m*200nm15mKClKBrCsI200nm18m*230nm25m 230nm50m一些材料的有效透明区18Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱300400500600700/nm350525 545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance35019苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱苯 (254nm )甲苯 (262nm)A230 250 270 20不同物质吸收光谱的形状以及max 不同 定性分析的基础同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形 状相同，Amax 不同 定量分析的基础218.1.3 光吸收基本定律:朗伯-比尔定律朗伯定律:(1760) A=lg(I0/It)=k1b当入射光的 ,吸光物质的c 一定时,溶 液的吸光度A与液层厚度b成正比.比尔定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c当入射光的 ,液层厚度b 一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.22朗伯-比尔定律意义:当一束平行单色光通过均匀、透明 的吸光介质时，其吸光度与吸光质点 的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.A=lg(I0/It)=kbc23透光率(透射比）T（Transmittance）A = lg(I0/It) = lg(1/T) = lgT = Kbc吸光度A (Absorbance）I0It入射光透过光24吸光度A、透射比T与浓度c 的关系AT (%)cA=kbc1.00.80.60.40.21008060402025K 吸光系数 Absorptivity a 的单位: Lg-1cm-1当c的单位用gL-1表示时，用a 表示，Aa b c 的单位: Lmol-1cm-1当c的单位用molL-1表示时，用 表示. 摩尔吸光系数 Molar Absorptivity A b c 当c的单位用g100mL-1表示时，用 表示, A bc， 叫做比吸光系数.26吸光度与光程的关系 A = abc 0.10b0.202b0.00光源检测器显示器参 比27吸光度与浓度的关系 A = abc0.10c0.202c0.00光源检测器显示器参 比28吸光度与波长的关系 A = abc0.00红0.10红0.00光源检测器显示器参 比蓝绿光红光29朗伯-比尔定律的适用条件1. 单色光 应选用max处或肩峰处测定.3. 稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强.2. 吸光质点形式不变离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件(酸度、浓度、介质等).30溶液浓度的测定A b c工作曲线法(校准曲线)朗伯-比尔定律的分析应用0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)A。 。 。 。*0.800.600.400.200.00Axcx318.1.4 吸光度的加和性与吸光度的测量A = A1 + A2 + +An用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。328.2 光度分析的方法和仪器方便、灵敏，准确度差. 常用于限界分 析.8.2.1 光度分析的几种方法1.目视比色法观察方向空白c1c2c3c4332. 光电比色法光电比色计结构示意图通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)34滤光片吸收滤光片：只允许指定的窄范围波长光 通过，其他波长的光均被吸收.选择滤光片的原则：滤光片透光率最大的光是溶液吸收最 大的光, 即滤光片的颜色与有色溶液的颜 色互补.353. 吸光光度法和分光光度计光源单色器吸收池检测系统分光光度计的基本组成通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调, 故选择性好, 准确度高.36分光光度计的主要部件光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(3202500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180375nm)氙灯：紫外、可见光区均可用作光源/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯（气体放电光源）氢灯强度37氙灯氢灯 钨灯38单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。 棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同. 玻璃3503200nm, 石英1854000 nm入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫1280060050040039光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度 等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便.平面透射光栅 反射光栅（广泛使用）光栅衍射示意图M1M2出 射 狭 缝光屏透 镜平面透 射光栅40吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池紫外区：石英池检流计（指示器）：低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管41硒光电池（Barrier-layer photocell）适用于300-800 nm, 在500-600 nm范围最灵敏 。Se阴极Au，Ag半导体h阳极42光电管(Phototube)h（片 ）红敏管 625-1000 nm