魚類病毒性神經壞死症 (Viral Nervous Necrosis Disease, VNN) 防疫手冊指導教授：古鎮鈞 學生：王茂麟 學號：1092407027齊肖琪目錄l病毒性神經壞死症 (VNN) 的起源l病毒性神經壞死症的病徵l神經壞死症病毒 (NNV) 的特性l神經壞死症病毒的基因型 (genotype) 與 血清型 (serotype)l神經壞死症病毒的地理分布與宿主範圍l溫度與病毒性神經壞死症爆發之關係l病毒性神經壞死症流行病學 (Epidemiology) 之研究l神經壞死症病毒引發之病程及在宿主體 內之分布l神經壞死症病毒的持續性感染l神經壞死症病毒的檢疫方法l神經壞死症的防治方法病毒性神經壞死症 (VNN) 的起源l病毒性神經壞死症 (Viral nervous necrosis disease, VNN disease)，最早發現 於 1986 年日本長崎縣 (Nagasaki) 的日本 鸚鵡魚 (Japanese parrotfish)繁殖場。l魚苗體長 6-25 mm，六、七月水溫升高 時發生大量死亡。l發病魚苗失去平衡，病魚的腦及視網膜 有壞死現象。l以電子顯微鏡觀察病變組織，發現大量 不具外套膜、型態介於圓形與二十面體 之間，直徑約 34 nm 之病毒顆粒，被認 為是造成此疾病的病原體，稱之為神經 壞死症病毒 (Nervous necrosis virus, NNV) (Yoshikoshi and Inoue, 1990)。病毒性神經壞死症的病徵 (石斑魚 )l疫情主要發生在八分苗或更小的苗，死 亡率接近 100%。l最早發病時間可在孵化後第 17 天，吋苗 死亡率仍有 70-80%，幼魚死亡率則較低 (圖 1)。l罹病魚苗在水面會有突發性的迴旋打轉 ，衝入水底再浮上水面。l魚苗體色變深，部份魚苗會發生脊椎側 彎，有時會側浮於水面上 (圖 2)。l魚苗發病時會食慾不振，群聚在池邊。l此病為急性傳染病，開始看見病徵後， 一週內會出現大量死亡。l一般光學顯微鏡下，檢查發病魚的病理 組織切片，都會有腦部及視網膜嚴重的 空泡化現象 (圖 3)。l以電子顯微鏡觀察病變的腦組織及視網 膜，可在發生空泡化的細胞內看到大量 病毒顆粒，散佈在細胞質內或留在膜系 胞器中 (圖 4)。神經壞死症病毒 (NNV) 的特性lNNV 病毒不具外套膜，型態介於圓形與 二十面體間，直徑約為 20-25 nm (圖 5) 。l有兩條不具 poly A tail 的單股正意核酸 (positive-stranded RNA)，其分子量分別 為 1.01 106 Da (RNA1) 及 0.49 106 Da (RNA2) (圖 6A)。lRNA1 可轉譯出分子量為 100 kDa 的蛋 白質，其功能為 RNA-dependent RNA polymerase。lRNA2 可轉譯成病毒的鞘蛋白質，由 42 kDa 及 40 kDa 所組成 (圖 6B)。l根據病毒型態、核酸特性，此病毒在分 類上屬於結病毒科 (Nodaviridae)、魚類 結病毒屬 (fish nodavirus；betanodavirus) (Mori et al., 1992；Nishizawa et al., 1995； Chi et al., 2001)。lArimoto 等 (1996) 用下列化學物質處裡 日本條紋鯵分離出來的 SJNNV 病毒株 ，可以使病毒失去活性： 1. 碘 (iodine) 50 ppm 處理 10 分鐘。 2. 氯 (chlorine) 50 ppm 處理 10 分鐘。 3. 紫外線 1.0 105 w. sec / cm2。4. 臭氧 (ozonation) 0.1 ppm 處理 2.5 分鐘。 5. 強鹼 (pH 12) 處理 10 分鐘。 6. 加熱 (60) 處理 30 分鐘。l由海鱸分離出的 NNV 病毒株能耐受 pH 2-9 之處理，亦可抵抗 56 加熱 30 分 鐘之處理 (Frerich et al., 1996)。l台灣養殖石斑魚分離出的 GNNV 病毒株 在強酸 (pH 3) 與強鹼 (pH 10-12) 的環境 下，病毒力價會下降約 104 TCID50 ，60 加熱一小時，則能使病毒失去活性 (Chi et al., 2001)。神經壞死症病毒的基因型 (genotype) 與血 清型 (serotype)l1994 年 Nishizawa 等人依據 SJNNV 的 RNA2 核酸序列設計出兩條順向引子 (forward primer) F1、F2，及三條逆向引 子 (reverse primer) R1、R2、R3。l以萃取出的病毒核酸作為模版，以 RT- PCR 的方式經不同引子對的組合進行反 應，可擴增出五種大小不同之目標片段 (T1,T2,T3,T4,T5)。l根據其中大小約 420 bp 的 T4 片段的核 酸序列比對，可將海水魚神經壞死病毒 分離株分成四種基因型 (Nishizawa et al., 1997)： 1.Striped Jack (SJ) NNV 2.Tiger Puffer (TP) NNV 3.Barfin Flounder (BF) NNV 4.Redspotted Grouper (RG) NNVl將 SJNNV 的鞘蛋白基因 T2 片段的核酸 序列和氨基酸序列與 NOV、BBK、FHV 、BOV四種昆蟲結病毒比較，相似度皆 在 28.6% 以下，胺基酸序列相似度則在 10.6% 以下 (Dasgupta et al., 1984；Dasgupta and Sgro, 1989；Kaesberg et al., 1990)。l其中 T4 片段核酸序列與其他三種魚類 結病毒基因型分離株 (BFNNV、TPNNV 及 RGNNV) 相似度則高達 76% 以上， 胺基酸序列相似度則大於 81%，其中位 於第 83-216 個胺基酸之高度保留區 (highly conserved region) 的相似度更高 達 92.5% 以上，但此區昆蟲結病毒並不 存在。l因此，由海水魚分離出的結病毒在分類 上被成立一新的屬，為魚類結病毒屬 (Piscine nodavirus) 或稱 betanodavirus， 而昆蟲的結病毒則稱為 alphanodavirus (Nishizawa et al., 1995)。l純化四種 NNV 基因型病毒株製備兔子 多源抗血清，接著以交叉中和反應檢測 四種 NNV 基因型之間的血清類源關係 ，結果可分成三種血清型 (Nakai et al., in press)： 1. SJNNV 2. TPNNV 3. GNNV 以及 BFNNVl其中，雖然 BFNNV 的病例都發生在冷 水性的魚類；GNNV 的病例都發生在溫 熱水魚，但兩者在血清學上卻是十分相 近。神經壞死症病毒的地理分布與宿主範圍l病毒性神經壞死病毒為近十幾年來海水 養殖魚類死亡率很高的一種疾病。類似 的病例分布於世界各地。美國l自 1990 年迄今，世界各地已有超過 24 種魚受到此病毒感染並大量死亡 (Munday et al., 2002)。l目前感染魚類神經壞死病毒的宿主有 6 目 19 科 (表 1)。lSJNNV 基因型分離株的寄主專一性最高 ，至今只感染日本條紋鯵 (Japanese striped jack) 及赤鯮 (red sea bream) (Nishizawa et al., 1997)。lRGNNV 基因型分離株的寄主範圍最廣 ，包含 5 目 12 科，涵蓋淡、海水魚，至 今其宿主均屬溫水域之魚種。l台灣至少有 8 種魚可被 NNV 感染，其 中黃臘鯵 (yellow-wax pompano)、海鱺 (cobia)、歐洲鰻 (European eel)、赤鰭笛 鯛 (fire-spot snapper)，以及中國鯰魚 (Chinese catfish)皆為首次發現之宿主 (表 2,3) (Chi et al., 2003)。l根據病毒核酸序列比對，發現所有台灣 分離株皆屬於 RGNNV 基因型，核酸以 及胺基酸序列與日本分離的 RGNNV 相 似度皆高達 97% 以上 (圖 7)。l以往 NNV 僅有感染海水魚的案例，謝 等 (2001) 首度發現淡水養殖鰻及淡水養 殖鯰魚天然感染 NNV 之案例，並在鯰 魚引起 100% 之死亡率。l雖 NNV 如何自海水魚傳播至淡水魚仍 待研究，但可知海水或淡水不是 NNV 感染與否之關鍵。l在台灣，金目鱸魚苗以海水飼養，至幼 魚階段就會移至淡水環境養殖，故發病 後的殘活魚苗有可能是將 NNV 至海水 養殖環境傳播至淡水養殖環境的媒介， 此點推測有待日後進一步求證。溫度與病毒性神經壞死症爆發之關係目前分離的四種病毒株之發現如下：lRGNNV 皆發現於溫暖水域的魚種中lTPNNV、BFNNV 皆發現於冷水域魚 種lSJNNV 介於中間四種不同基因型 NNV 病毒的最適複製溫 度如下 (Iwamoto et al., 2000)：lBFNNV 15-20lTPNNV 20lSJNNV 20-25lRGNNV 25-30lTanaka 等 (1998) 以紅點石班 (redspotted grouper) 進行 NNV 的攻毒實驗得知，自 石班魚分離出的 NNV ，在高水溫比低水 溫更容易造成感染魚隻發病。l此溫度效應的影響亦在七帶石班 (sevenband grouper) 研究中被證實 (Fukuda et al., 1996)。lChi 等 (1998) 也證實分離自石班魚之病 毒株 GNNV，感染魚類細胞後，培養在 28-30 時，病毒核酸及蛋白質的複製 量及速率都比培養在 20-24 時來的多 及快 (表 4,5)。lNNV 在東南亞都是感染溫水魚，但在日 本或是北歐，冷水養殖魚也有病毒性神 經壞死症疫情的爆發。l以兩種不同水溫養殖魚分離出來的 NNV 做交叉病原性感染實驗，結果無法引起 此兩種魚的大量死亡 (Totland et al., 1999) 。l目前尚不清楚究竟是宿主的專一性或是 水溫才是造成此兩株 NNV 病原性差別 的主因。病毒性神經壞死症流行病學 (Epidemiology) 之研究lGlazebrook 等 (1990) 在金目鱸的實驗中 指出，NNV 會經罹病魚苗水平傳染給健 康魚苗。lLe Breton 等 (1997) 發現，希臘地中海沿 海箱網養殖的海鱸發生大量死亡的情形 是因引進受 NNV 感染的魚苗至鄰近養 殖場而造成水平傳染所致。l共養實驗中，感染 NNV 的日本條紋鯵 會傳播病毒至共養的健康條紋鯵魚苗， 且共養第六天的死亡率高達 100%。l其中影響死亡率高低的因素，還包括了 養殖密度以及罹病魚與健康魚的共養比 例 (Arimoto et al., 1993)。lArimoto 等 (1992) 利用 ELISA 檢測日本 條紋鯵種魚的卵巢、受精卵以及同批魚 卵孵出之魚苗，結果發現，當母魚體內 測到抗 SJNNV 抗體時，其所產出的卵 及孵出之魚苗接檢測的到病毒抗原，表 示 NNV 會垂直傳染。l歐洲海鱸生殖腺之粗萃取物中，以標示 有 DIG (digoxigenen-11-dUTP) 之 N12 探 針偵測到 NNV 核酸的存在 (Comps et al., 1996)。l在大西洋比目魚的研究中，指出帶原種 魚所產下的魚卵表面可能帶有 NNV 病 毒顆粒 (Grotmol and Totland, 2000)。l根據以上研究報告，垂直感染路徑確實 存在，只是和水平感染之嚴重程度有所 不同 (Munday et al., 2002)。l以人為感染方式對餌料生物進行感染， 發現此病毒可感染輪蟲 (Brachionu