l l 龙岩学院生命科学学院l 2012.5.21实验七、实验七、 琼脂免疫扩散实验琼脂免疫扩散实验一 实验目的：l理解双向琼脂免疫实验原理l掌握双向琼脂免疫实验操作方法l掌握双向琼脂免疫实验结果分析二 实验原理：l当可溶性抗原(蛋白质、多糖、类脂、血清、各种微生物培养液 等)与相应抗体在电解质存在的适当条件下相遇，经过一定时间 出现肉眼可见的沉淀现象，称沉淀反应。l用于此反应中的抗原又称沉淀原（precipitonogen）抗体则称 沉淀素(precipitin)。l可溶性抗原与抗体在含电解质的凝胶介质(通常用半固体琼脂， 起支持作用)内自由扩散，当相对应的抗原抗体相遇时，若比例 适当可出现白色沉淀线，称琼脂扩散试验l（agar diffusion test）。l沉淀线的形状、位置，与抗原的浓度、扩散速度相关。 l此方法可应用于以下方面：（1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行 初步估算。（2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗 体）（3）抗原或抗体相对分子量的估计l双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排 孔型、梅花孔型（见图1）图1 双向免疫琼脂扩散孔型 三孔型双孔型梅花孔型双排孔型双排孔型三 实验材料：1.高盐生理盐水的琼脂糖 2.待检血清、法氏囊抗原、法氏囊阴、阳性抗 体 3.载玻片、湿盒、吸管、打孔器、37恒温箱 、可调微量加样器等四 操作步骤： 1. 制板：用移液管吸取热琼脂3.5ml，平铺于载玻片上。2. 打孔：待琼脂凝固后，按图1梅花孔型打孔，孔径3mm,中心 孔与边缘孔距离3-5mm。用针头斜面向上轻轻挑去孔内琼脂 （勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底）。3. 封底：用酒精灯轻烤平皿底部致微烫，封闭孔底部，以防 侧漏。4.加样：用微量加样器将法氏囊抗原10ul加入中间孔内；将待检血清用生理盐水稀释成1：2、1：6、1：10 以及空白 （生理盐水）加入周围各孔中，每孔10ul 。5.将玻璃片置于湿盒内，于37温育，隔天观察结果。二、双向琼脂扩散试验 结果观察：沉淀线的位置、数目与形状等。图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系a、b：抗体 A、A、B：抗原A、B完全不同 A、A部分相同五 注意事项1.用琼脂浇载玻片时，载玻片必须保持水平位置， 玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖时要避免产 生气泡。 2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被加 满，又必须不使样品溢出孔外。 3.打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。六 思考题1.画出个孔间的沉淀线位置、数量、形态， 并予以简单的说明 2.对实验结果进行分析