实验二 PCR扩增实验三 PCR产物的纯化实验目的和要求学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技术.实验原理多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93- 95）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单 链DNA模板；而后在低温（3765）情况下，两条 人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合 ，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下， 以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模 板以53方向延伸，合成DNA新链。每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环都使两条人工合成 的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产 物得以2n的指数形式迅速扩增，经过2530个循 环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上 一般可达106107倍。lPCR 反应系统的组成 引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓 冲液。PCR仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系 统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。材料与试剂材料与试剂实验步骤实验步骤lPCR反应体系（每人小管）模板DNA0.5 ul (10ng) 引物10.2ul (10uM)引物20.2 ul (10uM)dNTPs1 ul (1mM) Taq DNA聚合酶0.2 ul(5U/ul)10缓冲液(Mg2+)3 ul去离子水25 ul 总反应体系30ul94变性5min后，开始以下循环：94变性反应40s55退火反应30s72延伸反应1min最后72反应2min3 3个循环个循环PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR产物电泳检测产物电泳检测lPCR产物分析取5ul PCR产物，采用1琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。l学生PCR实验结果A.从PCR产物中直接回收纯化DNA (Promega 公司 ) 1) 直接加100l纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30 300l PCR反应物；2) 进入C步骤。回收PCR产物常采用两种方法，即直接回收和从凝 胶中回收，目前有许多公司出售相关的试剂盒。DNA回收纯化B.从琼脂糖凝胶回收纯化DNA1) 用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用UV观察EB染色 条带；2) 用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长 波长（300nm）UV灯下操作，并快速操作， 以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶 ，一次操作可切取多至300mg的条带；3) 将300l (300mg) 琼脂糖条带转移至1.5ml离 心管。直接在65温育直至凝胶全部溶化（一 般可按公司提供的说明书进行）；4) 加等体积的溶液BE；5) 下接C步骤。C.纯化步骤 1) 将PCR产物转移至一个1.5ml的离心管，向其中加入等体积溶液BD，混 合均匀。2) 将步骤1所获溶液置于DNA纯化柱中，静置2min。3) 12000rpm离心1min，弃滤液。此时DNA片段被吸附于DNA纯化柱中的硅 胶膜上4) 加入500l溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。洗脱硅胶上吸 附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获取高质量的DNA片段5) 加入500l溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。6) 12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中的液体。去除残留乙醇，避 免乙醇影响后续酶促反应，同时也有利于DNA的充分溶解7) 将离心柱置于新的1.5ml离心管。向纯化柱的中央处，悬空滴加15l 溶luent(60预热)，静置min12000rpm离心1min，管底即为目 的DNA片段。贮存于-20备用。学生PCR实验结果(4l)PCR 产物纯化后(相当于 0.8 l原PCR产物）PCR 纯化并酶切后 (2l)3kb=62.5ng 1kb=21.0ng作业分析并讨论PCR扩增结果与纯化后结果