药品质量检测技术第六章 仪器分析v教学目标1.掌握紫外分光光度法及可见分光光度法的 基本原理2.掌握色谱法基本理论 3.了解分光光度法和色谱法在工业生产和科学研究 中的应用 v知识要点1.吸收光谱与物质结构的关系和光吸收基本定律 2.色谱法基本理论 v技能要点1.紫外-可见分光光度计的应用2.GC、HPLC、TLC的基本应用 学习目标第一节 分光光度法一、概述 二、紫外-可见分光光度法 三、红外分光光度法一、概述v分光光度法： 测定被测物质在特定波长处或 一定波长范围内对光的吸收度，对物质进行定 性、定量分析的方法称为分光光度法。v主要包括:紫外分光光度（电子光谱）法：吸收光波 长范围200400nm，可用于物质的定性和 定量分析。可见分光光度（电子光谱）法：吸收光波 长范围400760nm，主要用于有色物质的 定性和定量分析。 二者合称为紫外-可见分光光度法即UV-ViS红外分光光度法（IR，分子振-转光谱）： 利用红外吸收光谱对物质进行分析的方法，吸收光波长范围2.51000m，主要 用于已知结构的有机化合物鉴别（定性）二、紫外-可见分光光度法v光的基本特性v物质对光的选择性吸收v吸收定律v紫外吸收光谱的应用v紫外-可见分光光度计 光的基本特性光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波 动性可用波长、频率、光速c、波数（cm-1 ）等参数来描述： = c ； 波数 = 1/ = /c光是由光子流组成，光子的能量：E = h = h c / （Planck常数：h=6.626 10 -34 J S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。光的波长越短（频率越高），其能量越大。单色光：单波长的光（由具有相同能量的光子 组成） 白光（太阳光）：由各种单色光组成的复合光如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混合，也可成为白光，这两种颜色的光称为互 补色光。白光绿 500-580橙 600-650黄 580-600红 650-780紫 400-450蓝 450-480青蓝 480-490青 490-500光的互补色示意图物质对光的选择性吸收物质的颜色是基于物质对光有选择性吸收的结果而物质呈现的颜色则是被物质吸收光的互补色。物质的吸收光谱曲线：将不同波长的光依次通过某一固定浓度和 厚度的有色溶液，分别测出它们对各种波长 光的吸收程度，以波长为横坐标，以吸光度 为纵坐标作图，画出曲线，此曲线即称为该 物质的光吸收曲线（或吸收光谱曲线）-胡罗卜素咖啡因阿斯匹林丙酮几种有机化合物 的分子吸收光谱 图吸收定律吸光度：单色光通过溶液时被吸收的程度，用A表示。朗伯（Lambert）和比耳（beer）分别于1760年 和1852年研究了光的吸收与有色溶液按液层的厚 度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析 法的理论基础。如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化， 都影响物质对光的吸收，则上述两个定律可合并 为朗伯-比耳定律，得到：A=Kbc 此式为光吸收定律的数学表达式。 式中A称为吸光度； K是比例常数，与入射光的波长 、物质的性质和溶液的温度等 因素有关。v 吸收系数 A=Kbc中比例常数K称为吸收系数； 物理意义：单位浓度的溶液液层厚度为1 cm 时 ，在一定波长下测得的吸光度。在药品检验的实际工作中，通常有两种表示方 法：v质质量吸收系数a 当c的单位为g/L，b的单位为cm时，K用a表 示，称为质质量吸收系数这时朗伯-比耳定律为 ：Aabc。在药品检验中经常使用的是百分吸收系数，用（ E1%1cm）表示。 物理意义:当吸光物质溶液浓度为1%(1g/100mL) ，液层 厚度为1cm时，在一定条件下的吸收度。v 摩尔吸收系数 当式中浓度c的单位为mol/L，液层厚度的单位 为cm时，则用另一符号表示，称为摩尔吸收系 数，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为 1cm时，溶液的吸光度。其单位为L/molcm。 这时朗伯-比耳定律就变为：Abc紫外吸收光谱的应用v鉴别：同一物质在相同条件下，测得的紫外- 可见吸收光谱应具有完全相同的特征。对比吸收光谱特征参数比较吸收度比值的一致性对比吸收光谱的一致性v杂质检查：药物与杂质的吸收光谱有明显差别v含量测定：朗伯-比耳定律对照品比较法吸收系数法计算分光光度法紫外-可见分光光度计v仪器的基本组成部件单色器吸收池检测器显示光源一般由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显 示器（数据处理系统）五部分组成。光源钨灯或卤钨灯可见光源，3252500nm 氢灯或氘灯紫外光源，185375nm单色器（分光系统）包括狭缝、透镜系统（准直镜）和色散元件吸收池（比色皿）玻璃能吸收紫外光，仅适用于可见光区；石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区；要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）为了消除误差提高测量的准确度，两只比色 皿应配套使用检测器（又叫接受器、光电转化器）光电池 光电管 光电倍增管（检测弱光常用） 二极管阵列检测器信号显示器早期使用的是检流计、微安表、电位计、 数字电压表、自动记录仪等。现代的分光光度计广泛采用数字电压表、 函数记录仪、示波器及自动记录型装置和数据 处理台（称为工作站）。v紫外-可见分光光度计的类型单光束分光光度计: 常用的有751G型、752型、721型、722型。双光束分光光度计 ：常用的有710型、730型、UV-210型等。双波长分光光度计 ： 与单波长分光光度计的主要区别在于采用双单色器。T6T6新世纪紫外新世纪紫外- -可见分光光度计可见分光光度计v红外吸收产生的原理与条件v红外光谱法的应用v红外光谱仪三、红外分光光度法v红外吸收产生的原理与条件原理：当分子中某个基团的振动频率和红外光的 频率一致时，分子就吸收红外光的能量，从原来的 基态振动能级跃迁到能量较高的振动能级。物质对 红外光的吸收曲线称为红外吸收光谱。根据试样的红外吸收光谱进行定性、定量分 析和确定分子结构等分析的方法，称为红外分光光 度法。红外光谱产生的条件红外光的能量应恰好能满足振动能级跃迁所需要 的能量，当红外光的频率与分子中某基团的振动频 率相同时，红外光的能量才能被吸收。红外光与物质之间有耦合作用。分子必须有偶极 矩的变化。v红外光谱法的应用定性分析研究分子结构：如确定分子的空间构型，求化学键 的力常数、键长和键角及未知化合物的结构鉴定等。定性分析官能团的定性分析、已知化合物的鉴定官能团的定性分析肯定法：根据红外光谱的特征吸收峰，确认某基团的 存在。 如某化合物的IR谱，在官能团区1740cm-1有吸收 C=O，在指纹区1300cm-11150cm-1范围内有两个强 吸收峰CO，根据官能团区及指纹区的这三个相关峰：否定法：基于某个波数区间内的吸收峰对某个基团是 特征的，在谱图中若无此吸收峰出现，则说明此基团 在分子中不存在。已知化合物的鉴定用标准试样对照将试样的谱图与标准样品的谱图进行对照。 与标准谱图对照在没有纯净的标准物质时，可用标准谱图比较。未知物结构分析 未知物结构分析的一般步骤如下： 了解与试样性质有关的其他资料 了解来源 元素分析的结果 相对分子质量 熔点、沸点等物理性质和有关的化学性质 由元素分析结果和相对分子质量推算出分子式 计算不饱和度：n11价原子数目 n33价原子数目 n44价原子数目规定：双键(C=C、C=O)、饱和环状结构：=1 ；叁键(CC)：=2；苯环： =4。分子结构式中达到饱和时 所缺一价元素的对数，每 缺两个一价元素时，不饱 和度为一个单位试样的制备和红外光谱的制作被分析的试样应该是纯物质纯物质可以通过对试祥进行分离和精制的方法(如分 馏、萃取、重结晶、层析等)得到根据试样的性质，按照试验条件制作红外光谱图谱图的解析首先观察官能团区，解析第一强吸收峰属于何种基团的特征吸收峰。 如，羰基(C=O)在1820cm-11600cm-1有强吸收峰，其中：1820 cm-1 1750 cm-11750 cm-1 1725 cm-11740 cm-1 1720 cm-11740 cm-1 1720 cm-1找出该基团的全部或主要相关蜂，包括该基团在指纹区的吸收峰，进一步确认该基团的存在。然后解析第二强峰及其相关峰。 确定分子中各个基团或化学键所连接的原子或原子团，以及与其他基团的结合方式，并结合相对分子质量、不饱和度以及其他仪器分析结果等有关资料，推测分子的结构。与标准谱图进行对照在相同的实验条件下操作，将得到的红外光谱图与标准谱图进行比较，若两张谱图吸收峰的位置和形状完全相同，峰的相对强度一样，可以认为样品与该种已知物是同一物质。例 某未知物分子式为C8H8O，其IR谱如图所示，试 推测未知物的分子结构。 解：(1)根据分子式计算不饱和度：1+8+(0-8)/25苯环及CH3的 CH伸缩振动苯环的骨架振动单取代苯C=O的伸缩振动。因分 子式中只有一个氧原子 ，不可能是酸或酯，只 可能是酮，而且分子中 有苯环，很可能是芳香 酮。CH3的CH对称弯 曲振动s(CH)CH3的CH反对称弯 曲振动as(CH)(2)图谱解析综上所述，该化合物中有一个单取代的苯环、一个羰基(估计是芳香酮羰基)、一个甲基，根据分子式，推测未知物的结构式可能是:总结：3000cm-1 、1600cm-11500cm-1 苯环的骨架振动、指纹区 760cm-1，692cm-1单取代苯 1681cm-1强峰为C=O的伸缩振动 1363cm-1 CH3的CH1430cm-1CH3的CH定量分析红外光谱定量分析是通过对特征吸收谱带 强度的测量来求出组份含量。其理论依据是朗 伯-比耳定律。由于红外光谱的谱带较多，选择的余地大 ，所以能方便地对单一组份和多组份进行定量 分析。此外，该法不受样品状态的限制，能定量 测定气体、液体和固体样品。因此，红外光谱 定量分析应用广泛。但红外光谱法定量灵敏度 较低，尚不适用于微量组份的测定。v红外光谱仪色散型IR谱仪：利用单色器作为色散元件傅立叶IR谱仪：利用光的干涉作用进行测定，没有 色散元件第二节 色谱法一、色谱法概述 二、薄层色谱法 三、气相色谱法 四、高效液相色谱法一、色谱法概述色谱法的来源色谱法(chromatography)早在1903年由俄国植物学家茨维特最先发明并定义，他在研究植物叶的色素成分 时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管 内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分 互相分离形成各种不同颜色的谱带。他称之为色谱。这 种方法因此得名为色谱法，又称层析法。以后此法逐渐 应用于无色物质的分离色谱分离过程色谱分离的原理 当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固 定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结 构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强 弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反 复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间 不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱 后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测 。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础 色谱法分类 二、薄层色谱法(TLC)(thin layer chromatography)TLC的概念、分类、特点 概念： TLC法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开 容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得 色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并 可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测 定。 分类： 吸附薄层色谱：固定相为吸附剂，适于异构体的分离原理：产生差速迁移而得到分离分配薄层色谱：固定相为液体，适于同系物的分离原理：利用样品中各组分在固定相与流动相之间的分 配系数差别而实现分离胶束薄层色谱：以表面活性剂胶束溶液为展开剂的薄 层色谱原理：被分离组分在水、胶束和固定相三者之间形成 分配