1. Western Blotting1. Western Blotting方法方法n n直接法：直接法： 优点：优点：1.1.快速（一种抗体）快速（一种抗体） 2.2.没有二抗交叉反应引起的非没有二抗交叉反应引起的非特异性条带特异性条带缺点：缺点：1.1.免疫反应性降低免疫反应性降低2.2.无信号二级放大无信号二级放大3.3.抗体标记费时昂贵抗体标记费时昂贵, ,使用不方便使用不方便Western Blotting方法 间接法： 优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大,灵敏度高（多个二抗 结合位点）3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Marker 缺点：1.有交叉反应引起的非特异性条 带2.额外的二抗孵育以及条件优化Y YY YHRPHRPHRPHRPHRPHRPSuperSignalSuperSignal 底物与二抗底物与二抗HRP,APHRP,AP反应反应, ,显色或发光显色或发光5 5SuperSignalSuperSignal HRP,APHRP,AP标记二抗与一抗蛋标记二抗与一抗蛋 白复合物结合白复合物结合4 42 2漂洗和封闭漂洗和封闭1 1电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上3 3一抗与蛋白结合一抗与蛋白结合 ( (小鼠单抗小鼠单抗 或兔多抗或兔多抗) )间接间接Western BlottingWestern Blotting操作流程操作流程: : HRP（辣根过氧化酶 )AP（碱性磷酸酶）大小40Kd140Kd最佳酶活性PH：57PH：810酶活和二抗特异性 好于AP抑制剂氰化物， 硫化物 叠氮钠氰化物， 砷酸盐，有机磷， 二价阳离子螯合剂 稳定性零度以下稳定零度以下不稳定底物很多部分动力学特性快速慢价格便宜昂贵2. 2. 两种检测酶系统的比较两种检测酶系统的比较3. 检测方法 化学发光法: 灵敏、快速、高效、无害、特异性高 化学显色法: 方便、有毒、灵敏度较低、不易保存 同位素法 : 灵敏度高、不安全、 环境污染、不方便 和半衰期短 荧光底物法4. 4. 影响影响Western blottingWestern blotting成功的要素成功的要素n n蛋白抽提蛋白抽提/ /样品制备样品制备/ /电泳电泳n膜的选择和转膜n封闭液的选择和封闭条件的优化n一抗和二抗的选择以及稀释倍数的优化 n“通用”二抗n合适的底物：发光或显色底物n曝光时间的掌控nX- 光片,信号增强剂nStriping 抗体剥离buffernEraser it底片背景去除剂蛋白抽提/样品制备/电泳蛋白抽提 nM-PER培养细胞总蛋白提取试剂 Pro#78501, 78503, 78505 nT-PER动物组织总蛋白提取试剂Pro#： 78510 nB-PER细菌总蛋白提取试剂Pro#： 78243, 78248，78260，78266 nY-PER酵母总蛋白提取试剂Pro#:78990 ，78991，78998 和78999 nI-PER昆虫细胞总蛋白提取试剂 Pro#:89802 nP-PER植物细胞总蛋白提取试剂 Pro#:89803 nMem-PER真核膜蛋白提取Kit Pro#:89826 nNE-PER胞质 5/20,5/100) X000 TBS或PBS洗膜46次 X5min(0.05% Tween-20)加入二抗,室温孵育1h TBS或PBS洗膜46次X5min 底物孵育：8cm2/mL 曝光时间：3060 Sec底物选择：底物选择： 灵敏度灵敏度 方便与否方便与否 经济与否经济与否Pierce Western BlottingPierce Western Blotting底物一览底物一览SuperSignal Western 化学发光底物Western PicoWestern Pico底物和底物和KitKit Western DuraWestern Dura增强底物和增强底物和KitKit Western Western FemtoFemto 超高灵敏型底物超高灵敏型底物KitKit Pierce ECLPierce ECL LumiLumi PhosPhos碱性磷酸酶化学发光底物碱性磷酸酶化学发光底物Twice the flash. Half the CashSuperSignal 化学发光底物发光的原理和特点 高灵敏度：比化学显色法 高103-106倍 快 速：1 min 高特异性：高信/噪比 检测方便： X光片或CCD 检测 多次曝光：选择满意的信 号强度 反复检测：用不同特异性 抗体，对同一蛋白上不同 决定簇进行检测分析1. SuperSignal West Pico 化学发光底物是用于Western bloting 的最经济 高效的选择SuperSignal West Pico与ECLTM 发光强度和灵敏度比较 SuperSignal West Pico 5分钟 发光 ECLTM系统5分钟 发光结果：相同条件下:一抗1ug/mL,二抗20ng/mL， SuperSignal West Pico底物产生的光强度是ECL底物的2倍稳定性 常温下稳定保存至少1年，无须预热，直接使用 工作液常温下至少保持24小时，光或黑暗均可用图示：SuperSignal West Pico 与ECLTM 系统发光动力学比较：两种底物系统6h后 相对发光强度比较 信号持久性信号持久性信号持续至少6小 时，足够的时间来 优化曝光条件更节约宝贵的抗体更节约宝贵的抗体: : 极大的减少一抗用量,是同类产品一抗用量的1/5-1/10， 稀释倍数是10005000倍 二抗用量是同类产品二抗用量的至少1/10，稀释倍数是 2000010000倍 注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度 决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行点杂交 预实验，以确定具体的实验参数。SuperSignalSuperSignal 与与ECLECL花费比较花费比较如何选择合适的Pico底物或Kit 底物（50ml，100ml，500ml，1L） 标准检测Kit：500ml底物2ml山羊抗鼠，兔二 抗 完整检测Kit： 500ml底物2ml山羊抗鼠，兔二 抗1L封闭液4包洗脱液2. Pierce ECL Western Blotting Substrate 一半的价钱 无须优化任何条件 Pro#:32106(500mL);32209 (250mL)32109 (50mL)3. SuperSignal Dura-化学发光底物 24小时发光时间：比任何其它改良的HRP化学发光底 物提供的要长10倍； 10-14克级灵敏度 节省抗体：抗体稀释度达一抗1000-50,000和二抗 50,000 -250,000倍 立即产生强烈信号，特别适合CCD仪器检测 工作液稳定24小时；常温保存一年如何选择合适的如何选择合适的DuroDuro底物底物KitKit底物底物KitKit：20ml20ml 标准检测标准检测KitKit：100ml100ml底物底物1ml1ml山羊抗鼠山羊抗鼠 1ml1ml山羊抗兔二抗山羊抗兔二抗200ml200ml底物底物1ml1ml山羊抗鼠山羊抗鼠 1ml1ml山羊抗兔二抗山羊抗兔二抗4. SuperSignal Femto化学发光底物 最灵敏的化学发光底物： 10-15克 一抗稀释度：1/5000-100,000 二抗1/100.000-500.000 用于极端微量样品的检测 抗体珍稀样品的检测 稳定：4一年，室温半年 免费Pierce高质量二抗如何选择合适的如何选择合适的FemtoFemto底物底物KitKit底物底物KitKit：20ml20ml 标准检测标准检测KitKit：100ml100ml底物底物1ml1ml山羊抗鼠山羊抗鼠 1ml1ml山羊抗兔二抗山羊抗兔二抗200ml200ml底物底物1ml1ml山羊抗鼠山羊抗鼠 1ml1ml山羊抗兔二抗山羊抗兔二抗5. 5. 碱性磷酸酶化学发光底物：碱性磷酸酶化学发光底物： Pro#:34150SuperSignal 底物的突出优势 花费更少 强信号 824小时的发光时间 多种灵敏度选择：10-12-10-15 节约抗体:是其它底物用量的1/101/1000 底物稳定6. PIERCE 6. PIERCE HRP化学显色底物7. PIERCE 7. PIERCE AP化学显色底物n n底物与膜孵育底物与膜孵育n nX- X- 光片光片n n曝光时间的掌握曝光时间的掌握n n显影和定影液显影和定影液n n信号增强剂信号增强剂n n抗体剥离缓冲液抗体剥离缓冲液n n底片背景去除剂底片背景去除剂底片和曝光成败的最后关头底片和曝光成败的最后关头特别推荐：不需反复作特别推荐：不需反复作WBWB的选择一的选择一选择抗体剥离选择抗体剥离bufferbuffern n无须反复电泳和转膜，节省宝无须反复电泳和转膜，节省宝 贵时间贵时间n n节省珍贵的样品节省珍贵的样品n n温和的无气味配方，对娇嫩的温和的无气味配方，对娇嫩的 蛋白质丝毫无损蛋白质丝毫无损n n一份样品，一次电泳，一次转一份样品，一次电泳，一次转 膜，多次印迹，更多数据膜，多次印迹，更多数据 特别推荐：不需反复作WB的选择二 用于各种X光片的背景处理，例如常规的Western、 Northern、Southern、EMSA等。 特点/优点： 去除不需要的背景，包括过度曝光、抗体浓度过高，封 闭差，抗体/酶沉淀形成的高背景、阴影、杂点等 不需要费时的重复曝光 不需要重复优化各种实验参数 浓缩液可制备3升工作液 操作极为简便操作，哈哈操作，哈哈选择选择Eraser itEraser it底片背景去除剂：无须反复底片背景去除剂：无须反复 曝光即可获得背景干净的曝光即可获得背景干净的X X光片光片特别推荐三：直接在电泳胶上作特别推荐三：直接在电泳胶上作WBWB 解决了转膜难的问题 减少了因不完全转膜造成的误差 1ng的灵敏度 可剥离抗体和重新检测 Pro#：33500；33505；33510；33515；33550特别推荐四：特定蛋白质在不同组特别推荐四：特定蛋白质在不同组 织表达谱分析织表达谱分析vv将将1717种正常组织和种正常组织和1717种相应肿瘤组织如：脑，肾，肝种相应肿瘤组织如：脑，肾，肝 ，肺，皮肤，乳腺，卵巢，子宫，子宫颈，前列腺，膀，肺，皮肤，乳腺，卵巢，子宫，子宫颈，前列腺，膀 胱，甲状腺，肾上腺，食道，胃，结肠，直肠，点样于胱，甲状腺，肾上腺，食道，胃，结肠，直肠，点样于 NCNC膜，利用蛋白质免疫印迹技术来筛选和检测特定蛋白膜，利用蛋白质免疫印迹技术来筛选和检测特定蛋白 质在质在1717种正常组织和种正常组织和1717种相应肿瘤组织的表达情况。种相应肿瘤组织的表达情况。vv对照点对照点vv3434种样品种样品3 3张张NCNC膜微列阵，高通量分析膜微列阵，高通量分析vvPro#:81040-81058Pro#:81040-810585. 常见问题分析 比较均一的高背景 斑点或发泡式或闪烁式的高背景 信号弱或者无信号 非特异性条带 弥散型条带 白色条带/黑点/信号下降太快比较均一的高背景原因：解决办法抗体浓度太高优化/降低一抗和二抗浓度封闭液不适合比较尝试不同的封闭液封闭不完全封闭液的选择与优化 增加封闭液中蛋白质浓度 优化封闭时间和温度（RT至少1小时；4 过夜） 封闭液中加入Tween-20；浓度0.05 抗体稀释液中加入Tween-20；浓度0.05