胸膜肺炎放线杆菌apxA基因 的克隆、表达及免疫原性研究研 究 生： 富 亮 指导教师： 赵玉军 教授 徐福洲 博士 专业名称： 预防兽医学 研究方向： 动物传染病学 所在学院： 畜牧兽医学院 胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的 克隆、表达及免疫原性研究第一章 前 言 第二章 apxA基因的克隆与原核表达第三章 apxA表达蛋白的免疫原性研究猪传染性胸膜肺炎概况猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的呼吸道疾病，其病理特征是引起肺脏广泛的纤维素性渗出、坏死、出血、胸膜粘连，中性细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞的浸润，血管栓塞，纤维素沉积等。各种年龄猪对该病均易感，新疫区常急性爆发，急性感染尤其是2425日龄仔猪感染后表现出极高的发病率和死亡率，发病仔猪迅速死亡，死亡率达到20以上，最急性型可达80100 ，并且长期带菌而成为传染性胸膜肺炎再次爆发和流行的潜在传染源，给本病的控制和根除带来困难。同时本病在临床上常与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒等混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失。该病是国际上公认的危害现代养猪业的重大疫病之一。胸膜肺炎放线杆菌概述胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae APP），属于巴氏杆菌科 （Pasteurellaceae）放线杆菌属（ Actinobacillus）。APP是一种革兰氏阴性小 球杆菌，有荚膜，有菌毛，不形成芽胞，无 运动性，最近还发现该菌有鞭毛。胸膜肺炎 放线杆菌分两个生物型，即生物型和生物 型，生物型为辅酶（烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide ，NAD）依赖型，生物型为非NAD依赖 型。血清型是根据APP表面荚膜和脂多糖抗 原性的不同来划分的，现已发现15种血清型 ，1型-12型、15型属于生物型，13、14型 属于生物型。 APP菌体形态（G）APP主要毒力因子溶血素（Apx毒素）脂多糖（LPS）荚膜多糖(CPS)外膜蛋白(OMP)尿素酶(Urease)转铁结合蛋白（Tbp）粘附素溶血外毒素 （Apx毒素）APP产生的溶血外毒素Apx被认为是APP 最重要的毒力因子。在APP的15个血清型中，目前已发现产生四种不同的溶血毒素（ Repeats in the structural toxin，RTX），称为 Apx（Actinobacillus pleuropneumoniae- RTX- toxin，Apx），即Apx、Apx、Apx和 Apx。Apx的毒性最强，表观分子量为105-110kDa，具有很强的溶血活性和细胞毒性作用，分泌Apx的血清型有1、5、9、10和11。毒素型的操纵子包括：毒素激活基因apxC，毒素结构蛋白基因apxA，两个分泌基因apxB和apxD，其中apxC负责编码毒素激活蛋白，apxA编码毒素结构蛋白，apxB和apxD与毒素的分泌有关。 apxA基因的N端疏水区是Apx的免疫原区， apxA基因的C端是Ca2+结合区只对毒素发挥毒性产生作用。Apx毒素的表观分子量为103kDa105 kDa，除血清型10以外，其他血清型都可以分泌此毒素。Apx具有弱的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞也有细胞毒性作用。Apx毒素的表观分子量为120 kDa，是由2、3、4、6、8型APP菌分泌的，Apx没有溶血活性，但对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞有很强的细胞毒性作用。Apx毒素是新近发现的。研究人员发现任何血清型都能在体内分泌Apx毒素蛋白，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。当apxA与表达载体上的开放阅读框1（ORF1）在大肠杆菌中表达时，它有微弱的溶血活性和协同溶血作用（cAMP）。不同Apx毒素的生物学特性Apx毒素类型溶血活性细胞毒性分子量（kDa）分泌的血清型Apx强强105-1101、5、9、10、11Apx弱中103-105除了10型以外Apx无强1202、3、4、6、8Apx弱弱200所有血清型Apx操纵子基本结构CABD毒素激活基因毒素结构蛋白基因毒素分泌基因胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆 与原核表达 技术路线：apxA基因的克隆与测序重组表达质粒的构建与鉴定诱导表达诱导表达条件的优化PCR鉴定双酶切鉴定Western Blotting不同时间不同IPTG浓度不同温度apxA基因的扩增引物设计参照GenBank中apxA核酸序列（D16582） ，应用Primer5.0软件设计1对引物，其上下游引 物中分别含有EcoR和Xho酶切位点，预期扩 增长度为3158bp，由北京三博远志生物技术有限 公司合成。 上游引物： AGC GAA TTC ATG GCT AAC TCT CAG CTC G下游引物： AGC TCG AGA TCC ATT TGC TCC TCC ATapxA基因的PCR扩增结果 PCR扩增产物经 0.8%琼脂糖凝胶电泳显 示大小约为3.2kb，与预期大小一致 。重组质粒pTA的PCR和酶切鉴定结果 对重组质粒pTA 进行PCR和酶切鉴定： PCR扩增出约3.2kb的 目的条带；EcoRI和 XhoI双酶切后切出大小 分别为3.0kb和3.2kb的 两条带，结果表明目 的片段已克隆到质粒 载体上。 目的片段序列测定 pTA的测序结果与GenBank中发表的APP标准10型apxA基因（D16582） 进行同源性分析，结果表明，两端的同源性 分别为99.4%和99.6%。表明apxA基因已经成功克隆到pGEM-T easy vector克隆载体 中。重组表达质粒pETA的PCR 和酶切鉴定结果 对重组质粒pETA 进行PCR和酶切鉴定 ：PCR扩增出约3.2kb 的目的条带； EcoRI 和 XhoI双酶切后出现 5.9kb的空载体和3.2kb 的插入片段两条带。 鉴定结果表明目的片 段以正确方向插入原 核表达载体pET-32a中 。 不同时间诱导表达的 SDS-PAGE电泳图含有重组质粒的BL21（DE3）经IPTG 诱导后，可表达一相对分子量约120kDa的 融合蛋白，与实际预测大小相符，不同诱 导时间显示诱导后56h表达量最高。不同浓度IPTG诱导表达的 SDS-PAGE电泳图 将不同IPTG浓度诱导的样品进行 SDS-PAGE ，结果表明，IPTG浓度为 0.6mmol/L的蛋白表达量最高。不同温度IPTG诱导表达的 SDS-PAGE电泳图将不同温度诱导表达的样品进行 SDS-PAGE ，结果表明，在25条件下 表达的蛋白表达量最高。 重组质粒pETA表达产物Western blotting检测结果 表达蛋白经SDS- PAGE电泳后转印至PVDF 膜上，用兔胸膜肺炎放线 杆菌免疫血清作一抗，羊 抗兔IgG作二抗进行免疫印 迹检测。结果可见一条特 异性的抗原抗体结合带， 分子量大小与目的蛋白相 同，从而证明表达的目的 蛋白是apxA蛋白。裂解后SDS-PAGE电泳图 超声裂解后进行 SDS-PAGE：经超声波 裂解后离心，分别对 上清和沉淀进行SDS- PAGE。结果表明，目 的蛋白在沉淀物中， 故可判定目的蛋白以 包涵体形式存在。apxA表达蛋白的免疫原性研究技术路线：三种表达蛋白的纯化 及Western blotting分析 天然Apx毒素蛋白的提取免疫原浓度的测定与免疫小鼠用间接ELISA方法检测免疫后小鼠的抗体水平APP1型菌和APP10型菌 半数致死量（LD50）的确定与攻毒三种蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图 纯化后的蛋白经过SDS-PAGE，结果如 图所示，三种蛋白的大小分别为120kDa、 58kDa、79kDa。纯化后比较显示杂带减少 ，表明纯化效果良好。 三种蛋白的Western blotting检测结果 用APP10型菌免疫兔的阳性血清作一抗，用 HRP标记的羊抗兔IgG作 二抗，进行Western blotting分析，结果如图所示，三种蛋白都与阳 性血清反应，说明都具 有免疫原性。APP10型菌所提取的天然Apx 经过SDS-PAGE，如图所示，用饱和硫酸氨（NH4）2SO4）沉淀法提取天然ApxI毒素蛋白的大小为105110kDa。免疫原浓度的测定结果经BCATMProtein Assay Kit测得apxA表达蛋白浓度为2.5mg/ml、apxAN表达蛋白浓度为3mg/ml、apxAC表达蛋白浓度为2.4mg/ml、提纯的天然Apx毒素蛋白浓度为5 mg/ml。实验动物分组组别小鼠数量第一组：天然Apx毒素蛋白免疫组12只第二组：apxA表达蛋白免疫组12只第三组：apxAN表达蛋白免疫组12只第四组：apxAC表达蛋白免疫组12只第五组：空白对照组12只免疫程序与剂量将提取的天然Apx毒素蛋白和三种表达蛋白乳化后分 别免疫小鼠，共免疫三次，每次间隔两周。一免：将纯化的三种表达蛋白与提纯的天然Apx毒素 用PBS稀释，与等量的弗氏完全佐剂乳化制成疫苗，每0.2ml 疫苗中含有蛋白100g，进行多点皮下注射免疫。二免：将四种蛋白用PBS稀释，与等量的弗氏不完全佐 剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白150g，进行多点 皮下注射免疫。三免：将四种蛋白用PBS稀释，与等量的弗氏不完全佐 剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白200g，进行多点 皮下注射免疫。对照组用PBS与等量佐剂乳化后，对小鼠进行多点皮下 注射免疫。 小鼠免疫后的抗体效价 APP10型半数致死量（LD50）的确定 根据事先估计10型和1型的LD50，我们分 别利用三个梯度的10型菌和1型菌对小鼠进行 腹腔注射攻毒。 APP10型菌小鼠腹腔攻毒结果攻毒浓度2106CFU4106CFU6106CFU小鼠死亡数/总数1/63/64/6根据攻毒结果，我们确定APP10型菌的半数 致死量（LD50）约为4106CFU。注：分子为存活小鼠数;分母为试验小鼠数。APP1型半数致死量（LD50）的确定APP1型菌小鼠腹腔攻毒结果 攻毒浓度8105CFU1106CFU2106CFU小鼠死亡数/总数1/63/65/6注：分子为存活小鼠数；分母为试验小鼠数。根据攻毒结果，我们确定APP1型菌的半数致死量（LD50）约为1106CFU。攻毒结果第一组 第二组 第三组 第四组 对照组APP106/66/63/61/60/6APP14/63/62/60/60/6注：分子为存活小鼠数；分母为试验小鼠数。三免十天后试验组和对照组分别用 APP10型菌和APP1型菌5LD50的剂量进行 攻毒。24h内观察小鼠死亡情况及状态。 结 论1.本试验成功的从胸膜肺炎放线杆菌血清10型 基因组DNA中扩增出了编码Apx毒素结构蛋白的 apxA基因，经克隆测序显示其长度为3158bp。与 GenBank中发表的APP标准10型apxA基因（ D16582） 进行同源性分析，结果表明同源性达到了 99.4%以上。2.apxA基因在原核表达载体pET-32a中进行了 高效融合表达，表达产物分子量约为120kDa，最终 确定的理想诱导表达条件为：诱导温度为25、 IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导时间为5h，且Western blotting分析显示可与APP免疫血清发生免疫结合反 应。3. 纯化了apxA、apxAN和apxAC三种表达蛋白，apxA具有与天然Apx毒素类似的免疫原性，且N端免疫原性显著高于C端。4. 提取了天然的A