徐州师范大学 生命科学学院 微生物学实验吕爱军一、实验内容实验一 实验室环境和人体表面微生物的检查（3学时） 实验二 器皿的清洗包装及干热灭菌（3学时） 实验三 培养基的制备及高压蒸汽灭菌（3学时） 实验四 细菌的单染色及接种技术（6学时） 实验五 放线菌的形态观察（3学时） 实验六 细菌的革兰氏染色及芽孢染色（3学时） 实验七 细菌大小的测定（3学时） 实验八 酵母菌形态观察、死活细胞鉴别和数量测定（3学时） 实验九 温度对微生物生长的影响（3学时） 实验十 平板菌落计数法及比浊法（6学时） 实验十一 综合设计性实验（9学时）二、微生物实验安排与考核课程简介：必修课，45学时、1个学 分 基础实验：80%，10次 自主设计实验：20%，设计方案、实验操作、总 结、汇报 考试成绩按以下公式计算：平时（10）操作考试（20）笔试（70）三、课堂纪律u严格遵守实验室规章制度u严肃课堂纪律不允许无故旷课、早退（1次）迟到（2次）工作服四、实验室安全和卫生u安全 实验室严禁吸烟。 注意用水、防电和 防火 正确使用化学试剂 和仪器 u卫生 每次实验需留下6位同学值日，协助保 持实验室清洁实验一 实验室环境和人体表面微生物的检查一、实验目的1. 证明实验室环境与体表存在微生物。2. 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和 类型。3. 观察不同类群微生物的菌落形态特征。4. 体会无菌操作的重要性。二、实验原理平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在合宜温度下培养，1-2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。u三、实验材料棉签、平皿（1/1人）、酒精灯、废物 缸等u四、操作步骤 1、写标签： 在皿底上 2、制培养基 3、倒平板 4、静置 5、接种环境或体表微生物 手指（洗前后）、头发、咳嗽、抹布、空气中 等 6、培养 37 培养24h-48hu五、实验报告观察并记录结果，观察环境中细 菌菌落形态与类型。1. 认识微生物学实验基本材料及其清洗方法；2. 了解消毒和灭菌的原理，掌握干热灭菌方法的操作步骤；3.为后续实验做准备。一、实验目的实验二 器皿的清洗包 装及干热灭菌二、实验内容u（一）器皿的种类u1试管（test tube）：制作琼脂斜面、成液体培养基用、制作无菌水 用。u2吸管（又称移液管，pipette）：转移液体菌落 u3培养皿（petridish）：由正反两平面板互扣而成，专为防治空气中 微生物的污染而设计的。在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，用于分 离、纯化、鉴定菌种、微生物计数以及抗生素、噬菌体效价等。 u4三角烧瓶（Erlenmeyerflask）与烧杯（beaker）：三角烧瓶常用的 有100、250、500、1000ml等不同的大小，常用来成无菌水、培养基和摇瓶 发酵等。烧杯用来配制培养基和药品。u6载玻片（slide）与盖玻片（cover slip）：用于微生物涂片、染色 ，作形态观察用。u7接种工具 ：接种环、针、铲、钩。u8. 玻璃涂布器。u 1新玻璃器皿的洗涤方法：新购置的玻璃器皿含游离碱较多，因在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2%的盐酸或洗液。浸泡后用自来水冲洗干净。2使用过的玻璃器皿的洗涤方法 :(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯等可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。 (2)玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，免得干燥后难以冲洗干净。 （二）玻璃器皿的清洗方法u(3)载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在洗衣粉水中煮沸510分钟。 检查过活菌的载玻片和盖玻片，吸过活菌的吸管应先投入盛有2%的来苏水或0.25%的新洁尔灭消毒液中浸泡24h后，按上述方法洗涤。带病原菌的培养物应先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。u玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水均匀分布呈一薄层，表示污垢完全洗净，若挂有水珠，则还需要用洗液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。在洁净的载玻片上滴上水滴后应均匀散开。若成水珠状，还应进行充分洗涤。（三）培养皿的包扎培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。 吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要 塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑） ，然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈 60角，并将右端多余的报纸打一小结。试管的捆扎 （四）干热灭菌法1、原理利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。所需温度(160-170)，时间长(1-2h)。2、实验步骤恒温降温开箱取物升温装入待灭菌物品（五）紫外线灭菌法（示范）1、原理紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶 二聚体的形成和DNA 链的交联，从而抑制了DNA 的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电 离成O，再使O2 氧化生成臭氧或使水氧化生成 H2O2。O3 和H2O2 均有杀菌作用。适用于无菌室，接种箱，手术室内的空 气及物体表面的灭菌。1.清洗玻璃器皿，易碎，请注意规范操作，安全。2.干热灭菌法：（1）物品摆得不要太挤，以防空气流通，物品不要接触内壁，以防烤焦起火。（2）电热干燥箱观察窗的玻璃温度很高，避免直接接触导致烫伤。（3）干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。3.紫外线可以灼伤皮肤和眼睛,注意戴手套和防护镜操作。 三、实验报告注 意 事 项（一）实验目的1、明确培养基的配制原则；2、掌握配制培养基的一般方法和步骤；3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；4、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌 方法。实验三 培养基的制备及 高压蒸汽灭菌（二）实验原理培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基。培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基。常用加热灭菌法： 1、干热灭菌：用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌 2、湿热灭菌高压蒸汽灭菌法 间歇灭菌法煮沸消毒法灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、 过滤、照射和化学药品法等。培养基配方：四、实验内容高氏1号培养基：固体培养基牛肉膏蛋白胨培养基：液体培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基：由液体培养基加1.5-2 琼脂（一）、培养基的配制：同学们先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘 贴位置在离管口1/3管身处。注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。 操作图示：1.称量按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用称量纸或烧杯称量。培养基的制备过程 称量-溶解-调节pH值-过滤- -分装及包扎-灭菌-灭菌后试管 摆放斜面2.配调向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化时，需不断搅拌，并 控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失 水分。如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在 火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足 所失水分。3.调节pH值培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试 纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用 1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且 多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调 节。 4.过滤用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求 可省去。5.分装将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内， 管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起 污染。分装量可分为下面几方面： （1）斜面：装量为管长的1/4-1/5。 （2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基 ：装载量不超过管长的1/3。 （3）三角瓶：装量不超过容积1/2。（二）高压蒸汽灭菌 1、原理利用加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌 锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能 溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点 增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白 质凝固变性而达到灭菌的目的。一般培养基用0.1Mpa，121.5,1530min 2、步骤加水装待灭 菌物品加盖加热灭菌时间到后 断电源压力降为零 开箱取物6.灭菌塞棉塞，包扎，灭菌。高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100的蒸汽温度。在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。u高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。试管的分装灭菌后试管摆放斜面摆斜面试管的捆扎 棉塞制作（示范）注 意 事 项1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好 的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼 脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢； 4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高 的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶体 的1/2 ； 5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞 而引起污染。四、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指 明要点。五、作业题l配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什 么?2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如 何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?3.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？实验四 细菌的单染色及接种技术一、实验目的u学习并掌握普通光学显微镜的构造和油镜的使 用技术及维护的基本知识u学习微生物涂片、单染色的基本技术u初步认识细菌的形态特征，u学习无菌操作技术，掌握各种微生物接种的基 本操作技术。二、实验原理u细菌的单染色 细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色 。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体 与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形 态和结构。染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和 化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态 。 三、实验材料u普通光学显微镜u美兰、结晶紫、复红染色液。u培养24h的大肠杆菌（E.coli)、枯 草芽孢杆菌u载玻片、接种环、酒精灯、香柏油 、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。四、实验步骤（一）、制作细菌 观察片现场演示无菌操作涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检单染色方法 将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基 上，这个过程就称为接种。常用的几种方法如下：斜面接种液体接种平板接种（二）、微生物接种技术1.斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管 的方法。此法用于好气性微生物的接种