SDS-PAGE凝胶电泳实 验 二SDS-PAGE凝胶电泳实验原理 实验步骤 注意事项 SDS-PAGE的优点 SDS-PAGE的缺点实验常见问题及处理 小技巧实验原理l源起l基本原理l分类l分离范围源起l1967年由Shapiro建立。l1969年由Weber和Osborn进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝 胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋 白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚 基分子量的大小,电荷因素可以忽视.丙烯酰胺N,N-亚甲基双丙烯酰胺聚丙烯酰胺四甲基乙二胺(TEMED)过硫酸胺(AP)激活作用激活作用共聚合基本原理之一l阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间 及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质 变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充 分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。l强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的 二硫键使这种结合更加充分。基本原理之二l结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长 椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短 轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的 大小成正比。l这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移 率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的 影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根 据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小 分开。分类PAGE根据其有无浓缩效应，分为连 续系统和不连续系统两大类.连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝 胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要 靠电荷和分子筛效应。电泳槽电泳槽不连续系统l不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。浓缩胶l浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小， 孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过 大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的 区带。分离胶l孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以 使样品很好的分离.凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分 离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)， 这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓 缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸 解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右， 在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通 电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl- 蛋白质H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而 H2NCH2COO- 称为慢离子。浓缩效应之一浓缩效应之二电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度 低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所 以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使 蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子 和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界 面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之 间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩 成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百 倍。样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的 外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有 效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同 而形成一条条区带。电荷效应之一电荷效应之二与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在 水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状， 使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有 电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量 的不同。电荷效应之三在SDS-PAGE电泳中，由于SDS这种阴离 子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合 物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远 超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低 或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多 亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单 位，这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键 等非共价键。lSDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的 丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联 后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质 复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺 丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径 达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙 烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有 3% 的蛋白质。分离范围l凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌 胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数 。用515%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范 围如下表：丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD） 1512431016687.536945.057212双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为 1：29。上样缓冲液之一 上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以 溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样 缓冲液，用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样 缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二 硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离， 在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务 必注明，仔细区分。 上样缓冲液 之二l注意事项还原型上样缓冲液中含一定量的DTT（二 硫苏糖醇）或巯基乙醇，有轻微刺激性气味， 较易区分；含巯基的试剂有一定的毒性，为了安全 和健康，应穿实验服并戴一次性手套操作。上样缓冲液 之三使用说明 1.按每4 l蛋白样品加入1l蛋白上样缓冲液的比 例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。 2. 100或沸水浴加热35min，以充分变性蛋白 。 3. 冷却到室温后取上清直接上样到SDS-PAGE胶 加样孔内即可。 4. 通常电泳时染料到达胶的底端附近（0.5 1cm)即可停止电泳。增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔 内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油 或蔗糖，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加 粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩 散出来到电泳缓冲液中。指示剂检测电泳的行进过程，一般加入 泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。 上样缓冲液 之四单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24 h，冰箱、室温均可。 甲醇/冰醋酸固定液甲醇/冰醋酸固定液甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小 且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对 组织收缩较大(可收缩20左右)，可使材料变硬。 冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又 称为冰醋酸。常用0.30.5的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精 、氯仿混合。 染色剂考马斯亮蓝染色 常用染色方法 银染法金属离子染色法以考马斯亮蓝染色为例考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用 蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量 蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋 白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在 室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂 配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级 蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000gmL，是 一种常用的微量蛋白质快速测定方法。实验步骤试剂配制(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双 丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤 后置棕色瓶中。 4，12月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.9)：称取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L盐酸调 pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。（4）1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8):称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L 盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)： 称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸 调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml （）TEMED（四甲基乙二胺）（）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（ 2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（ 2ml），最后定容至10ml （）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀 （）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加 上述固定液250ml，过滤后备用（1）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml （1）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g， 甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解 后定容至1000ml（12）高分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400置-20保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3- 5分钟后上样。 （13）样品：兔血清. 聚胶前准备(1) 配制10过硫酸铵溶液(需每天新鲜配制 )。(2) 将单体储存液、缓冲液、水按照一定比 例配制成凝胶溶液。(3) 将灌胶装置准备好。(4) 待凝胶溶液平衡至室温(2325)后，真 空脱气15 min。l1）.安装膜具 l将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 将凡士林 均匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃 板封好。 称取2g琼脂糖加100ml蒸馏水，慢慢的煮 开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的( 无气泡)琼脂糖倒入支胶架三分之二高度， 快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中， 注意凹槽朝外，用夹子固定好，待凝固后 灌胶。l2）制备SDS聚丙烯酰胺凝胶 制备分离胶 30%丙烯酰胺5ml + 分离胶缓冲液 5ml +10%SDS 0.2ml +10%过硫酸铵 0.2ml + 蒸 馏水 9.6 ml；混匀后加入8ul TEMED,立即混匀 （不能有气泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶 时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿 3cm处，立即在胶面上用移液管加入1-2cm的蒸馏 水，静置，待凝胶聚合后（约30min），去除水 相，然后用吸水纸吸干残余的水。l制备浓缩胶 l30%丙烯酰胺 1.32ml + 浓缩胶缓冲液 1ml +10%SDS 0.08ml +10% AP 0.08ml + 蒸馏水 5.6 ml；混匀后加入8ul TEMED,立即混匀（不能有气 泡），灌入垂直板至离槽沿0.5cm处，插入梳子（ 不