生物化学实验生物化学实验 BiochemicalBiochemical ExperimentExperiment生物化学实验技术理论一、层析技术l1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离 多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法 (Chromatography)，由于翻译和习惯的原因又常称为 层析法。l80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开 始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、 亲和层析、吸附层析等。l几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术 ，在生化领域内得到了广泛的应用。一、层析技术l1、层析技术原理l2、层析技术分类l3、常用层析技术原理1、层析技术原理l层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合 物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分 以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相 ，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以 不同速度移动，从而达到分离的目的。l可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸 。2 2、层析技术分类、层析技术分类名称操作方式固定相流动动相分离依据分配层层析纸层纸层 析 薄层层层层 析液体液体溶解度离子交换层换层 析离子交换换柱层层析固体液体带电带电 性 静电电引力吸附层层析吸附薄层层层层 析 气体吸附层层析固体 固体液体 气体吸附力亲亲合层层析酶与底物 抗原与抗体固体液体配体专专一性凝胶层层析 凝胶过滤过滤固体液体分子大小3 3、常用的层析原理、常用的层析原理l l（1 1）分配层析）分配层析纸层析纸层析l l原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在 终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分 配系数（配系数（ ）。）。l ll l固定相内溶质的浓度固定相内溶质的浓度= 流动相内溶质的浓度流动相内溶质的浓度固定相：滤纸上吸附的水固定相：滤纸上吸附的水流动相：有机溶剂（正丁醇）流动相：有机溶剂（正丁醇）1 1 2 2 8 86464646432326464323216164848484816168 83232484832328 84 42020404040402 20 04 42 21212303040403 30 01 1 2 22 2纸层析纸层析l l纸层析是最简单的液一液相分配层析。纸层析是最简单的液一液相分配层析。l l滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时， 大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此， 纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混 溶的有机溶剂为层析的流动相。溶的有机溶剂为层析的流动相。l l对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的 温度条件下，温度条件下，R Rf f是个常数。是个常数。（2 2）离子交换层析）离子交换层析l l原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于 惰性基质上，从而分离介质中的组分。惰性基质上，从而分离介质中的组分。l l常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂 ：二乙烯苯）：二乙烯苯）l l阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基l l阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 l l可交换离子：阳离子：可交换离子：阳离子：NaNa+ +、H H+ +阴离子：阴离子：ClCl- -、OHOH- -示意图（交换树脂表面）示意图（交换树脂表面）示意图（离子交换过程）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子可交换离子（钠离子）交换离子交换离子不交换离子不交换离子示意图示意图水水 分分 子子B B物物 质质A A物物 质质（3 3）吸附层析）吸附层析l l原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固 体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才 离开，此为吸附现象。离开，此为吸附现象。l l吸附现象形成的原因：吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，吸附作用可能由几种作用力形成， 包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静 电引力电引力( (形成离子键形成离子键) )、氢键及范德华引力等。、氢键及范德华引力等。l l在不同条件在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能下，占主要地位的作用力可能不同，也可能 几种力同时起作用几种力同时起作用l l吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺 ；滑石、陶土、粘土。；滑石、陶土、粘土。吸附层析示意图吸附层析示意图吸附剂吸附剂易吸附分子易吸附分子不易吸附分子不易吸附分子（4 4）亲和层析）亲和层析l l原理：原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。l l专一亲和力分子对：专一亲和力分子对：酶与底物、特异性抗原与抗体酶与底物、特异性抗原与抗体、DNADNA和和RNARNA、激素和其受体、激素和其受体l l载体：载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。多孔玻璃。（5 5）凝胶过滤）凝胶过滤l l原理：原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。速度不同。l l物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。内，因此向下移动慢。l l凝胶物质：凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。电电 泳泳 技技 术术一一. .电泳的概念电泳的概念二二. .电泳技术分类电泳技术分类三三. .电泳技术基本原理电泳技术基本原理四四. .几种常见电泳方法的比较几种常见电泳方法的比较五五. .聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理一一. .电泳的概念电泳的概念l l带电质点在电场中移动的现象带电质点在电场中移动的现象。二二. .电泳技术分类电泳技术分类三三. .电泳技术基本原理电泳技术基本原理1.1.基本原理基本原理不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带 净电荷量，分子量及分子形状有关。净电荷量，分子量及分子形状有关。pH pH pIpI 分子带负电荷分子带负电荷, ,在电场中向正极移动在电场中向正极移动; ;pH 蛋 Glylmclclm蛋蛋m Gly Glyl凝胶中Cl为快离子， Gly为慢离子 ，蛋白质样品被夹在中间。缓冲 液样品浓缩胶分离胶缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品 浓缩效应示意图快离子慢离子蛋白质样品 E：每厘米的电压降EI(电流强度)/ (电导率)E与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动 率最大，在快离子后面形成一 个离子浓度低的低电导区，产 生较高的电位梯度，使蛋白质 和慢离子加速移动，蛋白质样 品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性lE：每厘米的电压降EI(电流强度)/ (电导率)lE与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动 率最大，在快离子后面形成一 个离子浓度低的低电导区，产 生较高的电位梯度，使蛋白质 和慢离子加速移动，蛋白质样 品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：l缓冲液成分及pH的不连续性l电位梯度的不连续性缓冲液浓缩胶 样品分离胶A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应 原理包括：l凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩 效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动， 从浓缩胶进入分离胶，速度变 慢，堆积浓缩。缓冲 液样品浓缩胶分离胶A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效 应原理包括：l凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩 效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动， 从浓缩胶进入分离胶，速度变 慢，堆积浓缩。缓冲 液样品浓缩胶分离胶A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应 原理包括：l凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩 效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动， 从浓缩胶进入分离胶，速度变 慢，堆积浓缩。缓冲 液浓缩胶分离胶A. 样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效 应原理包括：l凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩 效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“”极向“”极移动， 从浓缩胶进入分离胶，速度变 慢，堆积浓缩。缓冲 液浓缩胶分离胶B.电荷效应l蛋白质样品进入分离胶后pH增大(pH 8.9)，Gly解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。l由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。缓冲 液浓缩胶分离胶C.分子筛效应l分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。缓冲 液浓缩胶分离胶