国际上牛胚胎移植及胚胎工程 应用现状l桑润滋 河北农业大学动科院（071001）l 笔者于2002年6月20日7月8日和 2004年3月19日4月7日分别陪同省长钮 茂生、省委书记白克明率领的河北省经贸 代表团两次赴澳、新、韩三国访问。 l 2004年4月7月先后接待了澳大利亚 SPB的总经理刘永树先生、法国Salers（ 萨来尔）牛协会主席和阿根廷胚移专家 Carlos Munar（卡罗斯莫纳）到河北的 来访，就牛胚胎移植相关问题进行了交流 ，现将上述几个国家有关牛胚胎移植应用 情况归纳如下： 一、体内胚胎生产（超数排卵 ）与胚胎移植情况 l（一）阿根廷莫纳胚胎移植公司l1超排方法：l 0天放入第一个CIDR+肌注P4（50mg）+肌注 BE（2mg）；第7天撤掉第1个CIDR，放入第2个 CIDR+肌注P4（50mg）+肌注BE（2mg）；第11 天注FSH，早，晚各1次；第12天注FSH，早，晚 各1次；第13天注FSH，早，晚各1次；第14天注 FSH，早，晚各1次，并且早晨撤掉第2个CIDR， 早，晚各注PG1次；第15天早注FSH1次；第16天 17天发情，AI；第2324天采胚 l 2胚胎移植规模l 他们们用上述方法每年超排牛40005000头头，头头均获获可用胚胎6枚左右，最高1头获头获 69枚胚胎。l 法国Salers牛，每年胚移10000头以上，鲜胚妊娠率70%左右。主要用于选种。 表1 阿根廷莫纳胚胎移植公司用体内胚胎 鲜胚移植结果 受体发发情天数移植头头数受胎头头数 移植成功率（% ） 6.034221362.36.571045163.5 7.01502104369.4 7.51937134669.5 8.0135294169.6 8.534825071.8 合计计6191424068.5本结果为卡罗斯、莫纳在墨西哥本结果为卡罗斯、莫纳在墨西哥19941994年移植结果。胚胎为超年移植结果。胚胎为超 排排7 7天采得的桑椹胚和早期囊胚。天采得的桑椹胚和早期囊胚。其中其中, ,桑椹胚移植成功率为桑椹胚移植成功率为 66.6%,66.6%,早期囊胚为早期囊胚为72.09%72.09%。 二、用屠宰场母牛卵巢卵母细胞体外生 产胚胎l 据新西兰的海青兰讲，他们和新西兰皇家 农科院合作，每周可生产胚胎1000枚，每年生 产5万枚左右。 三、澳大利亚SPB采用活体采卵（OPU）、体外受精（IVF）和胚胎移植（ET）对牛进行集中繁殖 l 通过使用活体采卵（超声导向和阴道探头 （TVR）、体外受精、胚胎移植三项技术对 成熟供体进行胚胎生产和移植。l SPB采用OPUIVFET对牛进行集中繁殖 生产主要包括以下八个步骤：l1、健康检查，2、供体牛选择，3、卵子收集 ，4、体外受精和胚胎生产，5、受体牛选择与 同情发情处理，6、胚胎的移植，7、妊娠诊断 ，8、接产与产犊。l SPB公司采用活体采卵每年生产1万枚胚胎 左右。l第一步 健康检查l 供体母牛必须身体健康，生殖系统 良好，先前做过MOET的母牛或具有生 殖疾病的母牛被列为“劣质牛”，因为 这样的母牛不能高效而准确地生产胚胎 。先前做过MOET的母牛可能由于操作 或激素的原因造成粘连或卵巢囊肿、卵 巢静止等。 l第二步 供体牛选择l1、适宜活体采卵母牛的生理时期l（1）14月龄以上发情周期正常的青年牛和成 年母牛。l（2）分娩后恢复发情周期的泌乳母牛，且未 在产乳高峰期的母牛。l（3）干奶期的母牛。SPB（南太平洋生物技术 有限公司）认为，干奶期的母牛是最好的供体 选择。l（4）人工授精后34周未出现返情的母牛或 怀孕3个月以上的母牛。 供体牛群供体牛群供体牛群l第三步 卵子收集l1、活体采卵基本方法 l（1）先将母牛麻醉，并且使母牛保持站立姿 势。（2）将超声波探头插入阴道，探头会将 信号传输到荧屏幕上，从而在荧幕上出现卵巢 和卵泡的形态与位置，这种阴道探头有一个19 G的细针，该细针通过硅管与真空泵相连，细 针可以直接插入卵泡，将卵子吸入到收集管中 。 l2、活体采卵间隔时间及水平。l 母牛每周采卵1-2次。可间隔3-4天进行连 续的采卵，对于正常母牛，无须进行激素刺激 ；但是当母牛采卵数少于7个时，可用外源激 素进行适当调节。通常的做法是每14天做一次 外源激素刺激；每收集一次卵子，可培养发育 1.5-2.0个A、B级胚胎，这样一周采集2次，可 获3.0-4.0个优质胚胎。 l SPB每年每头牛可获胚胎约160枚。l3、影响活体采卵的因素及采卵效率。l （1）对于有过生殖疾病的母牛或做过 MOET的母牛，即使现在它们的生殖系统健康， 不能期望高于平均值；（2）老年母牛采卵数 少，并且质量很差；（3）泌乳期的母牛，尤 其在泌乳高峰期，采卵数会很低；（4）营养 状况十分重要，母牛处于能量与营养平衡时会 生产更多、更优的胚胎，但母牛不能过于肥胖 。l 专门的活体采卵人员可以在6个小时采集 25头左右。 第四步 体外受精与胚胎生产 l1、精液品质鉴定：l 用于体外受精的精液要进行品质鉴定。 先用提前鉴定的公牛精液与从屠宰场收集的 卵子进行实验。用这种方法来判断精液是否 可以成功受精，是否可以产生优良胚胎。这 一步非常重要，因为人工授精良好的公牛精 液不一定在体外受精时也表现良好。通常， 一个人工授精剂量的精液可以受精200个卵子 。 l2、卵母细胞成熟、精子获能、受精与早期胚胎培养l 收集的卵子检出后放进培养液并送到 实验室进行体外受精，受精后需培养7天 。受精液、培养液均为SPB自己配制。 l3、体外受精与胚胎发育有关指标l 用OPU的采卵数，世界平均水平（非激素处理），每头母牛可以一次采得58枚卵子。但是，即使大多数卵子都受精，也只 有25%30%的卵子发育为可供移植的胚胎 ，所以每头母牛每次采卵只获得1.52枚A 、B胚胎。运用激素可以提高获胚数，但是 不稳定因素也相应增加。 l4、性别控制与胚胎性别鉴定l （1）x、y精子分离l 采用流式细胞分离法l 2002年悉尼大学精子分离 速度2万/秒，720万/小时， 2004年SPB公司10万/秒，3.6 亿/小时，24小时可分离86.4 亿，按每头输精量1000万 1500万计算，每天分离的精子 可供864576头牛输精。主要 问题：一是分离速度慢，二是 对精子活力有影响。适用体外 受精或显微受精。l SPB目前正在研究x、y分离的新方法。即经荧光染色的精子放入流式细胞 分类器的流动小室中，然后经小孔中流 出，不让精子带电荷，通过紫外线激光 杀死y精子，红外激光杀死x精子，只选择一种精子，这样分离速度加快，方法 也简便。这种方法还在中试当中。 l（2）胚胎性别鉴定l SRYPCR鉴定法：l 借助显微操作仪从桑椹胚或囊胚中分离 几个细胞，提取DNA，用PCR扩增后，根据 荧光（亮）的为公，暗的为母。 l5、胚胎冷冻与移植效果l 所获胚胎用澳大利亚产冷冻仪进行常规冷冻。OPU和IVF胚胎进行冷冻，解冻后A级胚胎有40%在移植后产犊，B级胚胎为30%35%，性别鉴定的胚胎只能达到30%左右。 第五步 受体牛的选择与同期发 情处理 l1受体牛选择 l（1）不能带有传染性的疾病 l（2）超声波检查生殖器官：受体通过超声波 检查来发现繁殖系统疾病（如子宫感染、卵巢 囊肿），同时检查其是否怀孕。l（3）口、蹄、乳房和乳头检查：要彻底检查 受体的口（确定年龄和牙齿状况）、蹄、乳房 和乳头，有乳房炎以及蹄病的年老受体不能使 用。 l（4）身体结构良好，母性能力强，适合当地 气候条件。在受体选择过程中，其身体结构和 性情也是十分重要的：骨盆面积和宽度，蹄形 ，乳房与乳头结构，母性能力与产奶量是重要 方面。在任何情况下，受体应该选用适合当地 气候等条件的品种。 l（5）适宜作受体的年龄（胎次）：理想的受 体是断奶的初胎母牛（后代健康）。如果是奶 牛的话，最好是分娩后体重已经开始回升的奶 牛。用青年牛作受体时，它们一般对同期发情 处理敏感，并且移植妊娠率较高，但是难产率 高。 l（6）受体慎用疫苗和药物l 受体在处理的15天前至妊娠6周不能接种疫苗或药物治疗。否则影响受胎和胎儿发育。 l2受体牛同期发情l 除传统的PG法和孕激素方法外，目前采用 复合激素法为多，主要有以下两种方法。l 第一种：0天，从阴道放入CIDR，肌注P4 50mg，肌注BE 2mg。第7天撤除CIDR并注PG ，第8天再注BE 2mg，第9天发情。l 第二种：0天，从阴道放入第1个CIDR，第 10天撤出第1个CIDR,放入第2个CIDR，第16天 肌注PMSG，第18天撤出第2个CIDR并肌注PG ，第19-20天发情。 l3受体发情观察、标记与记录 第六步 胚胎的移植 l 1胚龄（胚胎发育阶段）与受体发情时间同步 l 因为体外生产的胚胎的耐受性较MOET胚胎差，因此受体应该在第7天或第7.5天进行移植，对于孵化囊胚， 受体应该在第8天进行移植。受体牛要在进行IVF的当天发情或进行IVF的前一天发情（采卵当天发情）。通常， 对于无激素刺激而收集卵子的母牛，一个供体要准备2.5 头受体；激素刺激而收集卵子的母牛，一个供体要准备 3.5头受体。这样，根据黄体数量与质量来选择受体。 l2、胚胎的移植l 体外受精7天后开始移植（通常是采卵后8 天），体外生产的鲜胚有50%的成功率，冷冻 胚胎有40%的成功率，性别鉴定后而移植的鲜 胚与非性别鉴定的胚胎有相似的成活率。 lOPUIVFET技术按如下顺序进行：l第-1天：活体采卵。l第0天：体外受精。l第1天：体外胚胎培养。l第5天：后期培养条件的改变以及胚胎受精、 发育的鉴定。l第7天：第1次胚胎发育的最终鉴定，发育较快 的胚胎可以移植或冷冻。l第8天：第2次胚胎发育的最终鉴定：可以进行 移植或冷冻。l 胚胎性别鉴定可以在第7天或第8天进行， 然后移植鲜胚。 第七步 超声波检测妊娠情况胚胎移植后1518天，受体母牛如 果不出现发情现象，可认为它们已经有 可能怀孕。但是也有假妊娠的母牛。通 过超声波技术可以控制妊娠情况，可以 检测出发育35天（移植后28天）的胚胎 是否妊娠。 第八步 接产与产犊1IVF犊牛初生重大，容易造成难产l 有报道称妊娠期的平均胚胎丢失率在2% 10%之间。SPB的数据显示，胚胎的丢失率在2% 5%，并且表明通过给予适当注意，加强管理可以降 低这一数字。大多数丢失发生在妊娠前几天至妊娠 40天，因此选择在移植第六周进行妊娠检查，从而 避免人为造成流产。通过MOET技术所生的犊牛出 生重较AI和自然繁殖的重2%3%。体外受精较AI 和自然繁殖的重5%。