教学目标1. 能简述动物细胞培养的过程，能解释原代培养、传代培养、细胞株、细胞系等概念。q2. 能列举动物细胞培养技术的应用q3. 能描述动物细胞融合的方法过程q4. 能复述并写出单克隆抗体的制备过程，并 能列举单克隆抗体的应用教学重点、难点q1.重点：动物细胞培养、动物细胞融合、单克 隆抗体的制备q2.难点：动物细胞培养、单克隆抗体的制备q分析：学生第一次接触动物细胞培养的内容， 有许多新的名词，同时教师多数也没有做过类似 的实验，没见过实物，没有亲身体验，讲起来也 很容易照本宣科。单克隆抗体的制备是对动物细 胞培养技术、细胞融合技术的具体运用，过程相 对复杂，也属于难点。 三、动物细胞工程【回答二个问题回答二个问题】- -建构支架建构支架 （1 1）动物细胞生活在什么）动物细胞生活在什么 环境中？其主要成分是什环境中？其主要成分是什 么？么？（2）动物细胞培养的培养 基应模拟体内什么环境？其 主要成分有哪些？ 与植物细胞培养基相比，动物细胞培养液的独特之处：（1） 液体培养基（2） 其成分中有动物血清（3） 碳源为葡萄糖动物胚胎或幼龄动物 的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系遗传物质 未改变遗传物质改变 ，无限增殖（二）动物细胞培养（二）动物细胞培养【明确四个概念】1.动物细胞培养过程动物细胞培养过程细胞 悬浮 液10代 细胞50代 细胞传代培养无限传 代细胞系遗传物质改变细胞株原代培养随细胞增多且细胞贴壁生长。只有少数细 胞继续分裂 增殖【明确四个概念】要能界定原代培养和传代培养 ；细胞株和细胞系。理解传代培养的原因。例（06浙江）下列关于动物细胞培养的叙 述，正确的是A培养中的人效应T细胞能产生单克隆抗体B培养中的人B细胞能够无限地增殖C人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株D用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞D说明高度分化了的动物体的细胞在现在的科学条件 下不能经脱分化再恢复分裂能力；能培养成细胞株 的细胞一定具有分裂能力或能恢复分裂能力的休眠 细胞。人体细胞的动态分类更新组织：如上皮细胞、血细胞（含干细胞）。稳定组织：可补偿性增生，如：肝、肾细胞。恒久组织：细胞不再分裂，如神经、骨骼、心肌细胞 。 可耗尽组织：如人类的卵巢实质细胞。动物细胞培养的主要对象（1）为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培 养材料？因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强 且代数低。【理解四个问题】 （4）在动物细胞培养中，用到胰蛋白酶的地方是一次 吗？为什么？不只一次，应是传代次数+1（3）动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新 个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育 成新的动物个体（现在条件下无全能性）。（2）为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？成块组织有接触抑制现象，分散了做成细胞悬浮液利 于培养动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维 等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和 韧性的组织和器官（接触抑制现象）。【弄清四个原因】-帮助学生理解 （1）为什么动物组织细胞要用胰蛋白酶处理？（2）为什么要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来 ？大多数组织细胞不适应悬浮生长，它们必须在 固定的表面上生长和分裂。细胞在培养瓶中贴壁生 长，随着细胞越来越多，当贴壁生长的细胞分裂生 长到表面相互接触时就停止分裂增长，这种现象叫 做接触抑制。需要定期用胰蛋白质酶使细胞从壁上 脱下来，传代培养。（3）胰蛋白酶会消化细胞吗？胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质为， 长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损 伤作用；作用时间太短，细胞不容易脱落，因 此必须控制好作用时间。实际应用中的处理： 做预实验，摸清效果最好时的胰蛋白酶的用量 和作用时间。（4）细胞培养中 “危机”出现的原因干细胞简介干细胞简介 干：有树干、茎干的起源之意。干：有树干、茎干的起源之意。 干细胞：干细胞：理论上是指具有理论上是指具有无限自我更新能力（有细无限自我更新能力（有细 胞周期）胞周期）和和多方向分化潜能多方向分化潜能的一类细胞。的一类细胞。按照按照出现阶段出现阶段可分为可分为: : 胚胎干细胞：胚胎干细胞：取自囊胚的内细胞层，取自囊胚的内细胞层，具有具有全能性全能性即具有分化为几乎全部组织和器官即具有分化为几乎全部组织和器官的能力。的能力。 成体干细胞：成体干细胞：取自成体细胞取自成体细胞，如造血干细胞，如造血干细胞按按分化能力可分为可分为全能干细胞全能干细胞: :如受精卵，胚胎干细胞如受精卵，胚胎干细胞多能干细胞多能干细胞: :如造血干细胞，神经干细胞如造血干细胞，神经干细胞专能干细胞专能干细胞: :如肌肉中的成肌干细胞如肌肉中的成肌干细胞（2004江苏）下列人体细胞中分化程度最 低的是 A胚胎干细胞 B造血干细胞 C胰腺细胞 D肌肉细胞受精卵至囊胚期细胞原肠胚以后的细胞细胞分裂 、分化细胞分裂 、分化代数低代数高受精卵细胞 分裂全能干细胞细胞分裂 细胞分化代数低代数高休眠细胞多能干细胞分化了的细胞休眠细胞专能干细胞分化了的细胞细胞分裂 细胞分化根据以上三幅图能否得出以下结论：动物胚胎发育的早期，动物细胞在进行细 胞分裂的过程中，随着代数的增高，子细胞中 有一部分细胞进行了细胞高度分化，分化成了 各种组织细胞；一部分细胞进入了休眠期，使 其细胞代数停留不变，还有一部分细胞继续进 行分裂并分化成代数较高的各种专能干细胞。动物体细胞分裂能力一般为60代，不同生 物的体细胞分裂一代所用时间不同。2.动物细胞培养技术的应用（2）获得大量自身的皮肤细 胞，用于植皮。 （1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆 抗体等。生产病毒疫苗：利用动物细胞培养获得的细胞作为 病毒的宿主，培养脱毒的病毒疫苗。 生产蛋白生物制品：利用杂交瘤细胞生产干扰素、 单克隆抗体等。利用贴壁生长和接触抑制原理 ，为大面积烧伤病人移植取自病 人皮肤的健康细胞培养的自身皮 肤细胞，避免免疫排斥。（3）获取干细胞对内脏器官进行修复（专能干细胞的体外培养） （4）用于检测有毒物质 （5）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治 疗和预防疾病提供理论依据 将培养到细胞株阶段的干细胞，用于器官修复（如心 脏功能修复；肝肾功能修复）等。（海军医院曾完成过 利用干细胞改善严重心衰病人心脏功能的病例）根据致畸、致癌物质加入培养液后，导致培养细胞发生 染色体变异的细胞占全部培养细胞的百分数，判断某种物 质的毒性。（渗透实验设计教学：记数实验）医学家培养各种正常的或病变的细胞，用于生理、 病理、药理方面的研究（观察细胞的形态、结构和代谢 方面的变化），为治疗和预防疾病提供理论依据。（6）成为基因工程的下游工程基因治疗 在基因治疗中，修复后的患者细胞须经过细胞培 养增殖成细胞株后，再进行细胞移植。（三）动物细胞融合 1.展示动物细胞融合过程 诱导细胞膜 穿通细胞膜 连接细胞融合 形成杂种 细胞【理解四个问题】 （1）把动物细胞融合与植物细胞杂交相比较，动物细 胞融合过程相当于植物细胞杂交过程的哪一步？ （2）动物细胞融合与植物细胞杂交的基本原理是什么 ？ （3）细胞融合的具体步骤是：细胞膜的流动性动物细胞融合相当于植物细胞杂交的原生质体 融合过程。先进行膜穿通，再完成细胞质融合，细胞核的融 合则是在第一次有丝分裂时完成的。（4）诱导动物细胞融合与植物细胞杂交的方法共同点 有哪些？诱导动物细胞融合的常用方法是什么？仙台病毒紫外线丧失感染性（不感染细胞）保留融合活性 （诱导细胞融合）物理法：离心、振动、电刺激化学法：聚乙二醇（PEG）共同方法动物细胞融合的常用方法：化学法和灭活的动物病毒【引导学生阅读下面一段文字，思考以七个问题】长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复 注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方 法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特 异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生 免疫反应的过程中，体内的效应B细胞可以产生多达百万 种以上的特异性抗体，但是每个效应B细胞只分泌一种化 学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体 ，就必须用单个效应B细胞进行无性繁殖。（2）从动物血清中分离出的抗体有什么缺点？（1）什么是抗体？是由什么细胞产生的？（3）请从以上文字资料中提炼出单克隆抗体的概念（4）取效应B细胞进行细胞培养能获得单克隆抗体吗？（5）我们学过的哪种细胞具有无限增殖的能力？（6）有什么方法能使具有产生抗体能力的效应B细胞和 具有无限增殖能力的肿瘤细胞合二为一呢？（7）你能设计出制备单克隆抗体的实验方案吗？目的是 引发学生思考q实验目的:制备单克隆抗体.q实验原理：B淋巴细胞能产生抗体，骨髓瘤细 胞能无限增殖，杂交瘤细胞既能产生抗体又能 无限增殖。q实验材料：小白鼠q实验器材：培养皿、针筒等等。q实验过程：如下页提供：根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国提供：根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国 科学家柯勒设计的实验方案科学家柯勒设计的实验方案: :（四）单克隆抗体的制备（四）单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备过程：效应B淋巴细胞瘤细胞 融合抗原处理鼠第一次筛选杂交瘤细胞 培养 筛选 产生特定抗体的细胞群扩大培养 并留种体外体外或或体内体内培养培养提取单克降抗体（2005广东）关于单克隆抗体，下列叙述 不正确的是 A、可以制成诊断盒用于疾病的诊断 B、可以与药物结合，用于病变细胞的定向 治疗 C、可以利用基因工程技术生产 D、可以在生物体内生产，不能体外生产D【理解五个问题】 1.为什么要用抗原刺激小鼠？ 2.小鼠只产生一种效应B细胞吗？ 3.为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与效应B淋巴细胞融合? 4、就两两融合而言，细胞融合的方式有哪几种类型？5、单克隆抗体制备过程中有几次筛选？ 两次。第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），第二 次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的 情况下开始培养，然后再筛选出继承了双亲遗传物质的 杂交瘤细胞，即不仅具有效应B细胞分泌抗体的能力，而 且还具有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗 体。【弄清三个问题】1.单克隆体和单克隆抗体的区别 2.骨髓瘤细胞就是癌细胞吗? 由单个细胞经培养增殖而形成的相同细胞群体叫单克隆 体（细胞克隆）；杂交瘤细胞经细胞培养合成分泌的抗 体叫单克隆抗体。有无限增殖能力（失去凋亡机制，失去接触抑制等）的 细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞称为癌细 胞，所以说，瘤细胞不能等于癌细胞。3.如何筛选出杂交瘤细胞？ （1）淋巴细胞合成DNA 有D和S两条途径，其中 D途径能够被氨基嘌呤阻 断。一般不分裂增殖。（2）骨髓瘤细胞是特殊 选择的代谢缺陷型细胞 ，其DNA合成过程只具 有D途径，能被氨基嘌呤 阻断。（3）杂交瘤细胞则即可 无限增殖，又具备两条 DNA合成途径。加入了 氨基嘌 呤的选 择培养 基第一次筛选第二次筛选HAT培养液 细胞合成DNA有两条途径：一为主要途径，利用糖和氨基酸合成核苷酸，可被 氨基碟呤可阻断；二为补救途径，通过磷酸核糖转化酶（HGPRT）或 胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷 合成核苷酸。骨髓瘤细胞缺乏HGPRT和TK（无补救途径）；B细胞具有HGPRT（有补救途径），但在体外不能长 期培养，自然死亡；杂交瘤细胞从B细胞获得HGPRT或TK基因在HAT培养 基上生长繁殖。（五）单克隆抗体的应用1、用于临床诊断（利用抗体与抗原的特异性结合） 2、形成“生物导弹”治疗肿瘤 目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许 多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、 内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是 一