第一节 含生物碱类成分的分析一、含生物碱类成分中药制剂的定性鉴别(一)生物碱的沉淀反应(1)生物碱的酸性水溶液或稀醇（小于50%）溶液中，滴加硅钨 酸、磷钨酸、磷钼酸试剂数滴，生成（BH+）4Si（W3O10）4沉淀（ 淡黄色或灰白色）、3BHPO412WO32H2O沉淀（白色至褐色）、 3BH3PO412MoO32H2O 沉淀（白色至黄褐色，加氨水转变为兰色）。(2)生物碱的酸性水溶液或稀醇（小于50%）溶液中，滴加碘- 碘化钾试剂数滴，产生棕色或褐色沉淀，BH+ + I2-K+I- BI2HI（棕、褐色） + K+(3)生物碱的酸性水溶液或稀醇（小于50%）溶液中，滴加碘化 铋钾、碘化汞钾试剂数滴，产生红棕色沉淀、类白色沉淀。BH+ + BiI3KI BBiI3HI（红棕色） + K+BH+ + HgI2KI BHgI22HI（类白色） + K+ (二)生物碱的色谱鉴别1薄层色谱法 首先用适当的溶剂提取生物碱，提取液经浓缩 后直接或经过必要的净化后，点在薄层板上，层析后喷洒生物碱显 色剂，再根据生物碱的特性，选择特异的颜色反应或荧光，并应用 纯品对照，或标准药材对照，同时须作阴性对照后确定。如用硅胶 为吸附剂时，一般应用碱性系统展开剂较多，或使生物碱的薄层分 离在碱性环境下进行。2纸色谱法 多为薄层色谱所代替，利用多缓冲纸色谱来快速 鉴别乌头中双酯类生物碱和醇胺类生物碱有其独到之处。3高效液相色谱法 在恒定的高效液相色谱条件下，各种生物 碱都具有一定的保留时间，可作为定性鉴别的参数。一般要求取得 两个色谱系统的保留时间，或应用二级管阵列检测器作出鉴定。 4气相色谱法 适用于具挥发性且过热不分解的生物碱分离和鉴 定，目前在应用上有一定的局限性。二、含生物碱类成分中药制剂的含量测定(一)经典化学方法1.重量法 重量法测定中药制剂中生物碱多为测定其总生物碱的 含量。本法可用于混合总碱、未知结构或分子量相差较大的生物碱 的含量测定。缺点是挥发性生物碱不宜用此法，在蒸发提取溶剂或 加热、干燥时能分解破坏以及加碱使生物碱游离时可发生水解的生 物碱也不可用此法。本法取样量大，得到的残渣在称量的准确度内 方可应用。应用本法要求定量的将生物碱提取完全，并尽可能除去 杂质，须注意选择合适的提取溶剂。实例 见P135 苦参片中苦参总碱的测定2容量法(1)酸碱滴定法：a.游离生物碱不溶于水，可先将生物碱溶于过量标准酸溶液中 ，再用标准碱溶液回滴。b.游离生物碱能溶于水或水-乙醇溶液中的可直接滴定。c.生物碱盐在水或乙醇介质中，用强碱溶液滴定。一般使其溶于 90乙醇溶液中，可用标准碱乙醇液滴定，用酚酞作指示剂。 (2)两相滴定法： 因边滴边使游离生物碱溶于有机溶剂中，不 致影响终点的观察。更重要的是由于游离生物碱进入有机相，明显 地增大了生物碱盐的电离常数pKa。生物碱盐在两相中的水解为 pKa(D)=pKa - log(1+PC)，即与分配系数有关。一般的测定方法是 称取生物碱盐类溶于水中(加氯化钠少许)，然后加一定量有机溶剂 ，用氢氧化钠标准溶液进行滴定，并不断搅拌振摇。常用的有机溶 剂有氯仿、乙醚等，以氯仿用的较多，常用的指示剂如酚酞。如滴定剂选用酸性染料作为生物碱的两相滴定，则称之为酸性 染料滴定法。利用在一定的pH条件下，酸性染料能与生物碱结合而 定量地被有机溶剂提出，当滴定到达终点时，由于稍过量的酸性染 料，使水层产生颜色而指示终点。为了保证酸性染料与生物碱的结 合，可在水层中加入缓冲溶液。BH+ + In- BHIn本方法测定生物碱含量时，应注意选择合适的pH、合适的酸性染 料和合适的有机溶剂。酸性染料现以溴酚蓝、溴麝香草酚蓝及溴甲酚绿应用较多。有机 溶剂应用最多的是氯仿，其次是苯和二氯乙烷。要求有机溶剂应对 生物碱与酸性染料结合物有很好的溶解度。(3)络合滴定法： 重金属盐类如碘化铋钾、碘化汞钾和碘化 镉钾等可使生物碱或其盐生成沉淀，将沉淀溶解，然后用络合滴定 剂直接滴定原来沉淀中的重金属；或者滤出沉淀，滴定滤液中剩余 的过量的重金属而求得生物碱含量。本测定方法手续繁琐，目前仅 应用于原料药材的生物碱含量测定，在中药制剂中应用较少。(4)沉淀容量法： 利用多数生物碱与硅钨酸、雷氏盐、四苯 硼钠等试剂，生成沉淀，组成一定，直接或间接测定其含量。例如 生物碱或其盐类与一定量四苯硼钠溶液作用，过量的四苯硼钠用阳 离子表面活性剂如氯化十六烷基吡啶或氯化烃基二甲基苄基铵溶液 回滴过量的四苯硼钠，以溴酚蓝为指示剂，终点时多一滴以上季铵 盐溶液与溴酚蓝生成鲜蓝色络合物以指示终点，此方法亦多用于原 料药材的生物碱含量测定。(二)光谱法(1)雷氏盐比色法：生物碱与雷氏盐生成沉淀后，将沉淀分离 ，溶于丙酮，于520526nm波长处比色测定吸收度，换算生物碱的 含量。经实验证明生物碱的雷氏盐沉淀的丙酮溶液所呈现的吸收特 征，是由于分子结构中的硫代氰酸铬铵部分，而不是结合的生物碱 部分，其吸收值与样品或溶剂无关。硫代氰酸铬铵在丙酮中的克分 子吸收系数为106.5(单盐)或213.0(双盐)。故可根据其吸收值A按 下式直接测得样品重而不需绘制标准曲线。W =（ A/）MV/1000式中，M：生物碱雷氏盐沉淀的分子量，W：生物碱雷氏盐沉淀 的重量；A：吸收度；：克分子消光系数；V：丙酮毫升数。本方法可不需要标准对照品，但需注意生物碱生成单盐或双盐 ，并要注意样品的净化。(2)酸性染料比色法：在一定pH的介质中，生物碱B与氢离子H+ 结合成盐(BH+)，与某些酸性染料的阴离子In-结合成有色化合物 BH+In-，它能定量的被有机溶剂提取出来，此结合物碱化或酸化 后，即定量放出染料可进行比色，或测定该有色的有机溶液。此方法的关键：选择合适的pH、合适的酸性染料和合适的有机 溶剂。含有1个N原子的生物碱与酸性染料(溴酚蓝)生成分子1l的 结合物，与2个N原子的生物碱生成分子12的结合物(pH应较低 pH3.0 5.8)。此外，应防止操作时混入水分。同时也须注意带入 水相中过量染料影响测定的结果。实例 P147 延胡索乙素酸性染料比色法(3)苦味酸盐法：凡是在弱酸或中性溶液中能与苦味酸定量发 生沉淀的生物碱，都可按本方法测定含量。a.是滤取生物碱-苦味酸盐沉淀，加碱使生物碱-苦味酸盐解离 ，然后以有机溶剂提出生物碱，将苦味酸的碱性水溶液进行比色， 再换成生物碱的含量。b. 是在pH为7的缓冲液中，使生物碱与苦味酸结合成盐，用氯 仿提取此盐，然后再以pH为11的碱性缓冲液使氯仿中苦味酸盐解离 ，并将苦味酸提取到碱性水溶液中再进行比色。c.是直接在pH为45的缓冲溶液中，用氯仿提取生物碱苦味酸 盐，将氯仿提取液直接进行比色。（4）其他 如色谱-光谱连用技术、导数光谱法等实例： P141 小檗碱的紫外分光光度法P145 麻黄碱的测定（Cu2+-二硫化碳法）(三)色谱法1高效液相色谱 生物碱类成分进行高效液相色谱分析时 ，可采用正相、反相和离子对色谱，其中以反相高效液相色谱应用 较多。在反相高效液相色谱中为了克服游离硅醇基的影响，采取了 以下的措施，(1)流动相方面的改进： a.加入硅醇基抑制剂，最常用的硅醇基抑制剂是三乙胺;b.在流动相中加入离子对试剂;c.在流动相中加入季铵盐试剂，例如在水-甲醇流动相中加入 0.01molL的溴化四甲基胺。 机理是流动相不断地流入色谱柱后，即连续地添加掩蔽性试 剂(季胺盐)，被分离的碱性化合物和硅醇基之间的相互作用被阻碍 ，从而使生物碱类成分得到很好的分离。流动相中水-甲醇比例的 改变以及pH的变化都不影响峰的对称性。(2)固定相方面的改进：选择碳链较短的键合相硅胶填料，例 如C8比C18好。(3)增加流动相的脂溶性。(4)调整流动相的pH值,pHpKa+1或RHROCH3R-O-糖ROH 常用的溶剂系统有：甲苯-甲酸乙酯-甲酸(541)，分离黄酮甙元；苯 -甲醇(955)，分离黄酮甙元；苯-甲醇-乙酸(3555)，分离黄酮甙；氯仿-甲醇(82)，分离黄酮甙元及甙；苯-乙酸乙酯(7.52.5)或苯-丙酮(91)，分离黄 酮甙元衍生物如甲醚或乙酸酯中性成分；甲苯-甲酸乙酯-甲酸(541)，分离双黄酮成分。 溶剂系统中各组分的配比可根据薄层色谱的需要 加以调整。实例 淫羊藿的鉴别供试液制备 取本品粉末0.5g，加50乙醇30ml置水浴上回流 30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干乙醇后，加水少量溶解，加至聚酰 胺小柱上，先后用水，乙醇各lOOml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干 ，残渣用乙醇溶解，使成1ml，作为供试品溶液。对照液制备 取淫羊藿甙对照品，用乙醇制成0.5mg/ml的溶液 。薄层板 硅胶G加0.1M Na2HPO4的0.3CMC-Na+自制板；厚度 ：250um点样 供试品溶液10uL，对照品溶液2uL；条带状点样。展开剂 醋酸丁酯-甲酸-水(1.311)10以下放置后的上 层溶液。展开方式 展开剂预平衡15分钟；上行展开；展距：8cm显色 喷以5AlCl3乙醇溶液，105加热约数分钟后，置紫 外光灯(365nm)下检视。色谱识别 供试品色谱中，在与淫羊藿甙对照品色谱相应的位 置上，显相同的黄色荧光斑点。注意事项 温度在25以上；控制湿度在18-47范围内色谱 效果较好。 1 2 3 4 5 6 样品： 1.淫羊藿甙 2.淫羊藿 3.箭叶淫羊藿 4.朝鲜淫羊藿 5.柔毛淫羊藿 6.巫山淫羊藿2聚酰胺薄层色谱 聚酰胺薄层色谱用于分离含游 离酚羟基的黄酮甙与甙元较好。由于各种黄酮类成分取代 基团的性质、多少和位置的不同，与聚酰胺形成氢键的能 力有所差异而得到分离。一般说来，展开剂中大多含醇、酸、水，或二者兼有。 常用的溶剂系统有：甲醇-水(82)，分离黄酮甙元及甙 ，乙醇-水-乙酰丙酮(241)，水-乙醇-丁酮-乙酰丙酮 (13331)，苯-丁酮-甲醇(622)，分离黄酮甙元 ；甲酸-甲醇-乙酸乙酯(1218)，乙酸-水(12)，分 离黄酮甙。如鼻炎康片中黄芩甙的薄层色谱。取片剂细粉，加50 乙醇于60水浴中热浸30分钟，滤过，取滤液点于聚酰 胺薄膜上，用36醋酸展开，以黄芩甙为对照品，展开后 于紫外灯下观察（365nm)，黄芩甙呈紫色斑点，Rf值约为 0.30。 3纤维素薄层色谱 纤维素薄层色谱可用于分离黄 酮甙类较好，原理与纸色谱相同，色谱流动相可套用纸 色谱所有的流动相。常用的展开剂有，(1)正丁醇-乙酸-水(415)。(2)2甲酸；不同浓度的乙酸(6、10、40、 60)；乙酸乙酯-甲酸-水(823，上层)。(3)异丙醇-氢氧化铵-水(811)。a.黄酮类成分的纤维素色谱行为是：分子中酚羟基 增多时，无论用上述任意一溶剂系统Rf值均减少；当分 子中羟基为甲基或甲氧基所取代时，Rf值增加，b.黄酮甙分子中醇羟基增多，用不同浓度的乙酸展 开，Rf值增加，而用正丁醇乙酸水系统则相反。 二、黄酮类成分定量分析 (一)比色法最常用的是与铝盐反应，试剂为三氯化铝和硝酸铝。测定总黄酮时常用芦丁作对照品。实例 降压丸中芦丁的测定-铝盐络合比色法标准曲线制备 精密吸取芦丁液分别置于25ml量瓶中 ，分别加入5亚硝酸钠1.0ml，混匀，放置6分钟，加入 10硝酸铝1.0ml，混匀，放置6分钟，加入4氢氧化钠 溶液10.0ml，用水稀释至刻度，混匀，放置15分钟，在 500nm处分别测定吸收度。以吸收度为纵坐标，对照品液体积为横坐标绘制标准曲线。供试品测定 将丸剂粉碎，精密称取相当于