高效液相色谱 （high performance liquid chromatography,HPLC）中南大学湘雅医学院医学检验系 徐克前一 基本原理 （一）定义 HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和 流动相之间的分配系数不同，进行连续的 、无数次的交换和分配而达到分离的过程 。组成： 固定相柱内填料流动相洗脱剂（二）固定相（stationary phase)和 流动相（mobile phase）(1)化学键合相硅胶化学官能团键合到硅胶表面OH OH | | 硅胶（SiO2 nH2O） Si O Si | |键合相反应R1| | | | Si OH + XSiR Si OSiR + HX| | | |R2硅胶 有机硅烷 键合相X: Cl、CH3O、C2H5O等 R: 烷C8(C8H17) 、C10(C10H21) 、C18(C18H37)等 R1 R2: Z、CH3等(2)十八烷基硅烷键合硅胶填充料（ octadecylsilyl, ODS）万能柱即C18柱或ODS柱 主要用于反相HPLC中，适用于各种类型的生物 分子(3) 短链烷基键合物短链烷基（c3、 c4等）大孔硅胶 键合物适用于氨基酸、小肽等生物小分子(4)键合到基质上的官能团性质 反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，如 C18 、C8 、C4等 正相柱：填料是极性的，官能团为CN、NH2等 离子交换键合相：阳离子官能团：SO3H、COOHCOOH等等阴离子官能团阴离子官能团NHNH2 2、 R R4 4NN+ +等等2、流动相（mobile phase） 流动相选择原则： 1.样品易污，且溶解度尽可能大 2.化学性质稳定，不损坏柱 3.不妨碍检测器检测分析 4.粘度低，流动性好 5.易于从中回收样品 6.无毒或低毒，易于操作 7.易于制成高纯度，即色谱纯 8.废液易处理，不污染环境反相色谱常用流动相及冲洗强度反相色谱常用流动相及冲洗强度H H2 2OO甲醇甲醇 乙腈乙腈 乙醇乙醇 丙醇丙醇 异丙醇异丙醇 四氢呋喃四氢呋喃 最常用组成：甲醇最常用组成：甲醇/ /H H2 2O O、乙腈乙腈/ /H H2 2O O洗脱顺序：极性物先洗脱下来洗脱顺序：极性物先洗脱下来 正相色谱常用流动相及冲洗强度正相色谱常用流动相及冲洗强度 正乙烷正乙烷 乙醚乙醚 乙酸乙酯乙酸乙酯 异丙醇异丙醇二、分离模式 正相HPLC 反相HPLC 离子交换HPLC 凝胶HPLC 亲和HPLC（一）正相HPLC （normal phase HPLC ,NP- HPLC ） 固定相：极性吸附剂（或极性键合 相），如硅胶、Al3O2 流动相：非极性或弱极性溶剂，如己烷、庚烷等 洗脱顺序：非极性、弱极性、极性 应用：石油化工产品、染料、农药、医 药、有机酸、有机碱等（二）反相HPLC （reverse phase HPLC ,RP- HPLC ） 固定相：非极性物质，如C18(ODS)、 C10、C8 、C6 、C4 、C2 流动相：极性溶剂，如甲醇/H2O、乙腈/H2O等 洗脱顺序：极性、弱极性、非极性 应用：蛋白质、多肽等（三）离子交换HPLC （ion-exchange HPLC ,IE- HPLC ） 原理：用离子交换剂作固定相，根据不 同组分在一定pH下，组分电荷性质和数 量不同而分离的技术 分类：阳离子交换树脂：含酸性基团： 阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：磺酸基、磷酸基等磺酸基、磷酸基等合碱性基团：合碱性基团：季胺基、叔胺基等季胺基、叔胺基等 应用：应用：核酸、蛋白质、氨基酸等核酸、蛋白质、氨基酸等（四）凝胶HPLC（gel HPLC ,G- HPLC ） 原理：基于分子大小和形状的差异进行 分析的技术 固定相：交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶 流动相：水、乙醇、丙酮等 应用：核酸、蛋白质、酶、多糖等（五）亲和HPLC （affinity HPLC ,AF- HPLC ） 原理：利用生物大分子间专一的亲和力 进行分离的技术 固定相：基质（琼脂糖凝胶等）交联配 基（亲和性） 应用：酶、抗体、抗原、受体等三、 HPLC仪器HPLC仪 一般由输液系统、进样 系统、色谱柱、检测器、记录和 数据处理系统及计算机等几部分 组成（一）输液系统：贮液及脱气装置 梯度洗脱装置 高压输液泵梯度洗脱装置高压输液泵（二）进样系统：（三）柱系统：（四）检测器：与泵、柱组成HPLC的 三大关键部件1.紫外吸收检测器2.荧光检测器4.示差折光检测器 表.HLPC常用检测器检测器 原理 检测下限（g/ml） 检测范围 紫外检测器 具有紫外吸收性质 10-7荧光检测器 具有荧光物质 10-14电化学检测器 具有电解活性物质 10-12示差折光检测器 与流动相折光率不同 10-7 糖类等蛋白质、核酸蛋白质、核酸 、氨基酸、多、氨基酸、多 肽、激素等肽、激素等多环芳烃、氨多环芳烃、氨 基酸、维生素基酸、维生素 等等 食品、环境、食品、环境、 生化、医学等生化、医学等（五）不同HPLC产品介绍：高效液相色谱仪器（）高效液相色谱仪器（2）高效液相色谱仪器（3）高效液相色谱仪器（4）四、定性和定量定性分析 保留值定性：比较未知峰与标准物的保留 值收集未知峰洗脱液定性：物理分析，化学 分析，生物学 分析联机定性：液质联用（）液红联用（）定量分析 分析检测物质的量（或浓度）与检测器的 响应值（峰面积或峰高）呈正比 1.标准曲线法：也称外标法或直接比较法。用标准品等体积 直接进样，得标准曲线，再用待测样品的峰面积（或峰高 ）与其对照2.内标法：选择适宜的物质作为欲测组分的内标物加入到样 品中，内标物的选择是关键3.标准加入法：以欲测组分的纯物质作内标物加入到待测样 品中五、临床应用氨基酸的分析 蛋白质、酶及多肽 糖类 核酸类 药物及毒物